وائلڊ ٽيڪ ڊي اين اي پوليمريز
Taq DNA Polymerase Thermus aquaticus YT-1 مان هڪ Thermostable DNA پوليمريز آهي، جنهن ۾ هڪ 5′→3′ پوليمريز سرگرمي ۽ 5′ flap endonuclease سرگرمي آهي.
اجزاء
| جزو | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× طاق بفر | 2 × 1 ايم ايل | 2 × 10 ايم ايل | 2 × 50 ايم ايل | 5 × 200 ايم ايل |
| طاق ڊي اين اي پوليميرس (5 U/μL) | 0.1 ايم ايل | 1 ايم ايل | 5 ايم ايل | 5 × 10 ايم ايل |
رکڻ جي حالت
0 ° C کان هيٺ ٽرانسپورٽ ۽ محفوظ ڪيو وڃي -25 ° C ~ -15 ° C.
يونٽ جي تعريف
ون يونٽ انزائم جي مقدار طور بيان ڪيو ويو آهي جيڪو 15 nmol dNTP کي 75 ° C تي 30 منٽن ۾ تيزاب ۾ حل نه ٿيندڙ مواد ۾ شامل ڪري ٿو.
معيار تي ضابطو
1.پروٽين جي صفائي جو جائزو (SDS-PAGE):Taq DNA پوليميرس جي پاڪائي ≥95٪ SDS-PAGE تجزيي پاران طئي ڪئي وئي.
2.Endonuclease سرگرمي:گھٽ ۾ گھٽ 5 U جو تاق DNA پوليمريز 1 μg λDNA سان 16 ڪلاڪن لاءِ 37 ℃ تي نتيجو ڪو به پتو نه ٿو پوي جيئن طئي ڪيو ويو.
3.Exonuclease سرگرمي:1 μg λ -Hind Ⅲ DNA کي 16 ڪلاڪن لاءِ 37 ℃ تي ھضم ڪرڻ سان گھٽ ۾ گھٽ 5 U جو تاق ڊي اين اي پوليمريز جو اندازو لڳايو ويو آھي ته ڪنھن به قسم جي تباھيءَ جو پتو نه پوي.
4.نڪاس سرگرمي:گھٽ ۾ گھٽ 5 U جو تاق DNA پوليمريز 1 μg pBR322 DNA سان 16 ڪلاڪن تائين 37 ° C تي نتيجو ڪو به پتو لڳائڻ وارو تباهي نه ٿيندو جيئن طئي ڪيو ويو آهي.
5.RNase سرگرمي:1.6 μg MS2 RNA سان گھٽ ۾ گھٽ 5 U Taq DNA پوليمريز 16 ڪلاڪن لاءِ 37 ° C تي نتيجو ڪو به پتو نه ٿو پوي جيئن طئي ٿيل تباهي.
6.اي ڪوليڊي اين اي:Taq DNA پوليمريز جو 5 U E. coli genomic DNA جي موجودگي لاءِ اسڪريننگ ڪيو ويو آهي TaqMan qPCR استعمال ڪندي پرائمر سان E. coli 16S rRNA لوڪس لاءِ مخصوص.E. coli جينومڪ ڊي اين اي آلودگي ≤1 ڪاپي آهي.
7.پي سي آر ايمپليفڪيشن (5.0 kb Lambda DNA)- هڪ 50 µL رد عمل جنهن ۾ 5 اين جي ليمبڊا ڊي اين اي 5 يونٽ ٽاڪ ڊي اين اي پوليمريز جي 25 سائيڪلن لاءِ پي سي آر ايمپليفڪيشن جي نتيجي ۾ متوقع 5.0 kb پيداوار ۾.
رد عمل سيٽ اپ
| اجزاء | حجم |
| ٽيمپليٽ ڊي اين ايa | اختياري |
| 10 μM فارورڊ پرائمر | 1 μL |
| 10 μM ريورس پرائمر | 1 μL |
| ڊي اين ٽي پي مکس (هر هڪ 10 ايم ايم) | 1 μL |
| 10×طاق بفر | 5 μL |
| تاڪ ڊي اين اي پوليمريزب | 0.25 μL |
| نيوڪليس کان پاڪ پاڻي | 50 μL تائين |
نوٽس:
1) مختلف ٽيمپليٽس جي بهترين ردعمل جي ڪنسنٽريشن مختلف آهي.هيٺ ڏنل جدول 50 μL ردعمل سسٽم جي تجويز ڪيل ٽيمپليٽ استعمال کي ڏيکاري ٿو.
| ڊي اين اي | رقم |
| جينومڪ | 1 ng-1 μg |
| پلازميڊ يا وائرل | 1 pg-1 ng |
2) Taq DNA Polymerase جو بھترين ڪنسنٽريشن 0.25 µL ~ 1 µL کان خاص ايپليڪيشنن ۾ ٿي سگھي ٿو.
رد عملپروگرام
| قدم | گرمي پد(°C) | وقت | سائيڪلون |
| شروعاتي تباهيa | 95 ℃ | 5 منٽ | - |
| رد ڪرڻ | 95 ℃ | 15-30 ايس | 30-35 سائيڪلون |
| اينيلنگب | 60 ℃ | 15 ايس | |
| واڌارو | 72 ℃ | 1kb/منٽ | |
| فائنل توسيع | 72 ℃ | 5 منٽ | - |
نوٽس:
1) ابتدائي ٺهڻ واري حالت تمام گھڻا ايمپليفڪيشن رد عمل لاءِ موزون آهي ۽ ٽيمپليٽ جي جوڙجڪ جي پيچيدگي جي مطابق تبديل ٿي سگهي ٿي.جيڪڏهن ٽيمپليٽ جو ڍانچو پيچيده آهي، ته اڳ واري ڊينيٽريشن جو وقت 5 - 10 منٽ تائين وڌائي سگهجي ٿو ته جيئن شروعاتي ڊينيچريشن اثر کي بهتر بڻائي سگهجي.
2) annealing گرمي پد پرائمر جي Tm قدر جي مطابق ترتيب ڏيڻ جي ضرورت آهي، جيڪا عام طور تي مقرر ڪئي وئي آهي 3 ~ 5 ℃ پرائمري جي Tm قدر کان گهٽ؛پيچيده ٽيمپليٽس لاء، ضروري آهي ته اينيلنگ جي درجه حرارت کي ترتيب ڏيو ۽ وڌائڻ واري وقت کي وڌائڻ لاء موثر واڌارو حاصل ڪرڻ لاء.
