فاسٽ ايمپلي RT-qPCR پريمڪس پلس-UNG
ٻلي نمبر: HCB5144E
فاسٽ ايمپلي RT-qPCR پريمڪس پلس-UNG خاص طور تي ليوفيلائيزيشن پروسيس لاءِ تيار ڪيو ويو آهي، فلوروسينس ڪوانٽيفڪيشن لاءِ لاڳو ڪيو ويو آهي (TaqMan probe) RNA amplification detection with neocript reverse transcriptase ۽ ريپڊ ايمپليفڪيشن DNA پوليمريز حاصل ڪيل جينياتي طور تي تبديل ٿيل ۽ اسڪريننگ مڪمل ڪري سگھي ٿو PCR2 جي اندر. -40 منٽ.هي ريجينٽ اعليٰ روڪٿام رواداري پيش ڪري ٿو، جنهن ۾ اعليٰ ريورس ٽرانسڪرپشن ۽ پي سي آر ايمپليفڪيشن جي ڪارڪردگي آهي، جيڪا گهٽ ڪنسنٽريشن آر اين اي نموني جي اعليٰ حساسيت جي واڌاري لاءِ موزون آهي.هڪ سٺو معياري وکر هڪ وسيع مقدار جي حد اندر حاصل ڪري سگهجي ٿو، ۽ مقدار کي درست ڪري سگهجي ٿو.هي ريجنٽ استعمال ڪري ٿو هڪ مخلوط اينزيم جو مخالف inhibition amplification enzyme ۽ UNG enzyme، انهي سان گڏ هڪ بهتر بفر سسٽم جنهن ۾ dUTP شامل آهي.اهو نه رڳو نموني ۾ ٽارگيٽ جين جو سٺو واڌارو حاصل ڪري سگهي ٿو جنهن ۾ رڪاوٽون شامل آهن، پر اهو پڻ مؤثر طريقي سان غلط مثبت واڌارو کي روڪي سگھي ٿو جيڪو PCR جي بقايا ۽ ايروسول آلودگي سبب پيدا ٿئي ٿو.هي ريجنٽ اڪثر فلورسنٽ مقداري پي سي آر آلات سان مطابقت رکي ٿو، جهڙوڪ اپلائيڊ بايو سسٽم، ايپينڊورف، بايو-راڊ، روچ وغيره.هن reagent هڪ سٺي lyophilized فارم ۽ پيداوار جي استحڪام حاصل ڪرڻ لاء lyophilization لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو.
Reagent ساخت
1. 12.5×FastAmpli Part Taq/UNG Mix (dNTPs سان) (DG)
2. 50× فاسٽ ايمپلي پارٽ RTase (DG)
3. 5 × فاسٽ ايمپلي آر ٽي بفر (ڊي جي)
4. 4 × لائيوپروٽيڪنٽ (اختياري) (ڊي جي)
اسٽوريج جون حالتون
ذخيرو ٿي سگھي ٿو -20 ℃ ڊگھي مدت لاء، 4 ℃ تي 3 مھينن تائين.استعمال ڪرڻ کان اڳ چڱي طرح ملائي ۽ بچاءبار بار منجمد ٿيڻ.
سائيڪلنگ پروٽوڪول
|
قدم |
گرمي پد | باقاعده پي سي آر طريقو | فاسٽ پي سي آرطريقو |
سائيڪلون |
| عرصو | عرصو | |||
| ريورسنقل | 50 ℃ | 15 منٽ | 5 منٽ | رکو |
| پوليمريزچالو ڪرڻ | 95 ℃ | 1-5 منٽ | 1-2 منٽ | رکو |
| ڏند ڪٿا | 95 ℃ | 10-20 ايس | 1-3 سيڪنڊ | 40-50 |
| اينيلنگ / توسيع | 56-64 ℃ | 20-60 ايس | 3-20 سيڪنڊ |
RT-qPCR مائع رد عملآئن سسٽم
| بناوت | 25µL حجم | 50µL حجم | توجهه |
| 5×FastAmpli RT بفر | 5µL | 10µL | 1× |
| 12.5×فاسٽ ايمپلي پارٽ تاق/UNG مکس (dNTPs سان) | 2µL | 4µL | 1× |
| 50× FastAmpli حصو RTase | 0.5µL | 1µL | 1× |
| 4 × لائيوپروٽيڪنٽ | 6.25µL | 12.5µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix | 1µL | 2µL | 1× |
| سانچو RNA | - | - | - |
| ڊي ايڇ2O | 25µL تائين | 50µL تائين | 1× |
1. هي نظام هڪ lyophilization نظام آهي;جڏهن گراهڪ هن سسٽم کي ليوفيلائيزيشن جي ضرورتن کان سواء استعمال ڪندا آهن، 4 × lyoprotectant چونڊيل طور شامل ڪري سگھجن ٿيون؛جيڪڏهن لائوفيلائيز پراڊڪٽس گهربل آهن، مائع ريجينٽ اسٽيج پراڊڪٽ جي ڪارڪردگي جي تصديق دوران، ان کي لازمي طور تي 4 × لائوپروٽيڪنٽ شامل ڪرڻ گهرجي ته جيئن لائوفيلائيز سسٽم جي اجزاء ۽ اثرات سان مطابقت کي يقيني بڻائي سگهجي.
2. جڏهن باقاعده PCR طريقيڪار استعمال ڪريو، پرائمر جي آخري ڪنسنٽريشن عام طور تي 0.2μM آهي.بهتر نتيجن لاءِ، پرائمر ڪنسنٽريشن کي 0.2-1.0μM جي حد اندر بهتر ڪري سگهجي ٿو.جاچ ڪنسنٽريشن 0.1-0.3μM جي حد اندر بهتر ڪري سگهجي ٿو.پرائمر ۽ پروبس جو بهترين ميلاپ ڳولڻ لاءِ ڪنسنٽريشن گريڊينٽ تجربا ڪري سگهجن ٿا.
3. تيز پي سي آر ايمپليفڪيشن جو طريقو استعمال ڪرڻ وقت، پرائمر/پروب ڪنسنٽريشن کي وڌائڻ سان گڏ پرائمر ۽ پروب جي فيصد کي ترتيب ڏيڻ سان بھتر نتيجو حاصل ڪري سگھجي ٿو.
4. ٽيمپليٽس جي مختلف قسمن ۾ ٽارگيٽ جين جي مختلف ڪاپي نمبر شامل آهن.جيڪڏهن ضروري هجي ته مناسب بهتر نموني جي اضافي رقم کي چونڊڻ لاءِ گريڊيئيٽ ڊيليشن ڪري سگهجي ٿو.
Lyophilization سسٽم جي تياري
| بناوت | 25µL رد عمل سسٽم |
| 5×FastAmpli RT بفر | 5µL |
| 12.5×FastAmpli پارٽ تاق/UNG مکس (dNTPs سان) (DG) | 2µL |
| 50×FastAmpli پارٽ RTase (DG) | 0.5µL |
| 4 × لائو پروٽيڪنٽ | 6.25µL |
| 25×Primer-Probe Mix | 1µL |
| ڊي ايڇ2O | 18 ~ 20µL تائين |
* جيڪڏهن lyophilization لاء ٻين سسٽم جي ضرورت آهي، مهرباني ڪري الڳ الڳ صلاح ڪريو.
Lyophilization Process
| طريقو | عارضي. | وقت | حالت | دٻاءُ |
| منجهيل | 4 ℃ | 30 منٽ | رکو | 1 ايم |
| -50 ℃ | 60 منٽ | کولڻ | ||
| -50 ℃ | 180 منٽ | رکو | ||
| پرائمري خشڪ ڪرڻ | -30 ℃ | 60 منٽ | گرمائش | آخري ويڪيوم |
| -30 ℃ | 720 منٽ | رکو | ||
| ثانوي خشڪ ڪرڻ | 25 ℃ | 60 منٽ | گرمائش | آخري ويڪيوم |
| 25 ℃ | 300 منٽ | رکو |
1. هي لائوفيلائيزيشن عمل هڪ 25µL رد عمل سسٽم لاءِ ان-سيٽيو منجمد خشڪ ڪرڻ وارو عمل آهي.جيڪڏهن منجمد خشڪ ڪرڻ واري موتي يا ٻي جاءِ تي منجمد خشڪ ڪرڻ وارا عمل گهربل آهن، مهرباني ڪري الڳ الڳ پڇا ڳاڇا ڪريو.
2. مٿين lyophilization عمل صرف حوالي لاء آهي.مختلف پراڊڪٽ جا قسم ۽ مختلف فريز ڊرائر جا مختلف پيٽرول آهن، تنهنڪري استعمال دوران اصل حالتن مطابق ترتيب ڏئي سگهجي ٿي.
3. مختلف ليوفيلائيزيشن پروسيس مختلف بيچ جي سائيز لاء مناسب ٿي سگھي ٿي lyophilized مصنوعات، تنهنڪري ڪافي جانچ جي تصديق ٿيڻ گهرجي جڏهن وڏي پيماني تي پيداوار لاء استعمال ڪيو وڃي.
lyophiliz استعمال ڪرڻ لاء هدايتونايڊ پائوڊر
1. مختصر طور تي ليوفيلائيز پائوڊر سينٽرفيوج؛
2. لائوفيلائيز پائوڊر ۾ نيوڪليڪ ايسڊ ٽيمپليٽ شامل ڪريو ۽ 25µL تائين پاڻي شامل ڪريو؛
3. centrifugation ذريعي چڱيءَ طرح ملايو ۽ مشين تي هلايو.
معيار تي ضابطو
1. فنڪشنل جاچ: RT-qPCR جي حساسيت، خاصيت، پيداوار جي صلاحيت.
2. نڪي خارجي نيوڪليز سرگرمي، نڪي خارجي انڊو/exonuclease آلودگي.
ٽيڪنيڪل ڄاڻ:
1. تيز ڊي اين اي پوليمريز جي واڌ جي شرح 1kb/10s کان گهٽ ناهي.مختلف پي سي آر آلات ۾ مختلف حرارتي ۽ کولنگ اسپيڊ، گرمي پد جي ڪنٽرول جا طريقا ۽ حرارتي چالکائي هوندي آهي، ان ڪري توهان جي پرائمر/پروب ڪنسنٽريشن کي بهتر ڪرڻ ۽ توهان جي مخصوص تيز پي سي آر اوزار سان گڏ هلڻ جو طريقو ضروري آهي.
2. ريورس ٽرانسڪرپشن جو وقت بهتر ڪيو ويو آهي ٽڪڙي جي ڊيگهه مطابق وڌايو وڃي.ڊگھي ٽڪرن لاء، ريورس ٽرانسپشن جو وقت مناسب طور تي وڌايو وڃي ٿو.
3. annealing جي واڌ جي درجه حرارت کي پرائمر جي جاچ جي Tm قدر ۽ رد عمل جي حقيقي حالتن جي بنياد تي بهتر ڪيو وڃي.
4. پرائمر لاءِ جيڪي گھٽ اينيلنگ جي گرمي پد سان يا 200 بي پي کان وڌيڪ ٽڪرا آھن، 3-قدم طريقو سفارش ڪئي وئي آھي.
5. مھرباني ڪري وقف ٿيل علائقن ۽ پائيپٽ استعمال ڪريو ايمپليفڪيشن کان اڳ ۽ پوءِ، دستانا پائڻ ۽ انھن کي بار بار تبديل ڪريو؛PCR رد عمل مڪمل ٿيڻ کان پوءِ رد عمل واري ٽيوب کي نه کوليو پي سي آر پروڊڪٽس پاران نمونن جي آلودگي کي گھٽ ڪرڻ لاءِ.
6. dUTP جي استعمال جي ڪارڪردگي ۽ UNG اينزيم کي حساسيت مختلف ٽارگيٽ جين لاء مختلف آهي، اهڙيء طرح جيڪڏهن UNG سسٽم کي استعمال ڪندي پتو لڳائڻ جي حساسيت ۾ گهٽتائي ٿئي ٿي، ردعمل سسٽم کي ترتيب ڏيڻ ۽ بهتر ڪرڻ گهرجي.جيڪڏهن ٽيڪنيڪل سپورٽ گهربل آهي مهرباني ڪري اسان سان رابطو ڪريو.
