پروٽينين K mNGS (مائع)
Proteinase K وسيع ذيلي ذخيري جي خاصيت سان هڪ مستحڪم سيرين پروٽيز آهي.اهو مقامي رياست ۾ ڪيترن ئي پروٽينن کي خراب ڪري ٿو جيتوڻيڪ صابن جي موجودگي ۾.ڪرسٽل ۽ ماليڪيولر ڍانچي جي مطالعي مان ثبوت ظاهر ڪن ٿا ته اينزيم جو تعلق سبٽيليسين خاندان سان آهي جنهن ۾ هڪ فعال سائيٽ ڪيٽيليٽڪ ٽريڊ (Asp39-هن جي69-سر224).ڪليويج جو مکيه ماڳ پيپٽائيڊ بانڊ آهي جيڪو ڪاربوڪسائل گروپ جي الفا امينو گروپن سان گڏ aliphatic ۽ aromatic amino acids جي ڀرسان آهي.اهو عام طور تي ان جي وسيع خاصيت لاء استعمال ڪيو ويندو آهي.هي پروٽيناس K خاص طور تي mNGS لاءِ ٺهيل آهي.ٻين پروٽيناس K جي مقابلي ۾، ان ۾ اينزيميٽڪ ڪارڪردگيءَ سان اڃا به گهٽ نيوڪليڪ ايسڊ آلودگي شامل آهي، جيڪا بهتر نموني MNGS ايپليڪيشن کي يقيني بڻائي سگهي ٿي.
اسٽوريج جون حالتون
2-8 ℃ 2 سالن لاء
تفصيل
| ظاهر | بي رنگ کان هلڪو ناسي مائع |
| سرگرمي | ≥800 U/ml |
| پروٽين جي ڪنسنٽريشن | ≥20 mg/ml |
| نڪاس | ڪو به نه مليو |
| ڊي نيس | ڪو به نه مليو |
| RNase | ڪو به نه مليو |
ملڪيتون
| اي سي نمبر | 3.4.21.64(Tritirachium البم مان ٻيهر ملندڙ) |
| Isoelectric پوائنٽ | 7.81 |
| وڌ ۾ وڌ پي ايڇ | 7.0- 12.0 تصوير 1 |
| وڌ ۾ وڌ درجه حرارت | 65 ℃ تصوير 2 |
| pH استحڪام | pH 4.5- 12.5 (25 ℃، 16 h) تصوير 3 |
| حرارتي استحڪام | هيٺيون 50 ℃ (pH 8.0، 30 منٽ) تصوير 4 |
| اسٽوريج جي استحڪام | 25 ℃ تي 12 مهينن لاء 90٪ کان وڌيڪ سرگرمي |
| چالو ڪندڙ | SDS، يوريا |
| Inhibitors | Diisopropyl fluorophosphate؛phenylmethylsulfonyl fluoride |
درخواستون
1. جينياتي تشخيصي کٽ
2. آر اين اي ۽ ڊي اين اي ڪڍڻ واري کٽ
3. ٽشوز مان غير پروٽين جي اجزاء جو اخراج، پروٽين جي نجاست جي خرابي، جهڙوڪ ڊي اين ايويڪسين ۽ هيپرين جي تياري
4. pulsed electrophoresis ذريعي ڪروموزوم ڊي اين اي جي تياري
5. مغربي ڦوٽو
6. ويٽرو تشخيص ۾ اينزيميٽڪ گلائڪوسيلٽيڊ البومن ريجنٽس
اپاءُ
حفاظتي دستانو ۽ چشما پائڻ وقت استعمال ڪريو يا وزن ڪريو، ۽ استعمال کان پوء چڱي طرح هوادار رکو.هي پراڊڪٽ شايد چمڙي جي الرجڪ رد عمل ۽ سنگين اکين جي جلن جو سبب بڻائين.جيڪڏهن ساهه کنيو وڃي ته اهو ٿي سگهي ٿو الرجي يا دمما جي علامات يا dyspnea.سانس جي جلن جو سبب ٿي سگھي ٿو.
يونٽ جي تعريف
ون يونٽ (U) کي 1 μmol پيدا ڪرڻ لاءِ ڪيسين کي هائيڊولائيز ڪرڻ لاءِ گهربل اينزيم جي مقدار طور بيان ڪيو ويو آهي.tyrosine في منٽ هيٺ ڏنل حالتن هيٺ.
Reagents جي تياري
ريجنٽ I: 1g کير جي ڪيسين کي 50ml 0.1M سوڊيم فاسفيٽ محلول (pH 8.0) ۾ گھليو ويو، 65-70 ℃ پاڻيءَ ۾ 15 منٽ لاءِ انڪيوب ڪيو ويو، ٿلھي ۽ گھليو ويو، پاڻيءَ سان ٿڌو ڪيو ويو، سوڊيم ھائيڊروڪسائيڊ سان ترتيب ڏنل pH 8.0، ۽ فڪس حجم 100 ملي.
ريجنٽ II: 0.1M trichloroacetic acid، 0.2M sodium acetate، 0.3M acetic acid.
ريجنٽ III: 0.4M Na2CO3حل.
ريجنٽ IV: Forint reagent 5 ڀيرا خالص پاڻي سان ملائي.
ريجنٽ V: اينزيم ڊيلوئنٽ: 0.1M سوڊيم فاسفٽ حل (pH 8.0).
ريجنٽ VI: ٽائروسائن جو حل: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml ٽائروسائن 0.2 سان حل ٿيلايم ايڇ سي ايل.
طريقو
1. 0.5ml reagent I کي 37 ℃ تي اڳي گرم ڪيو وڃي ٿو، 0.5ml انزائم جو حل شامل ڪريو، چڱيءَ طرح ملايو، ۽ انڪيوبيٽ ڪريو.37 ℃ 10 منٽ لاء.
2. رد عمل کي روڪڻ لاءِ 1ml reagent II شامل ڪريو، چڱيءَ طرح ملايو ۽ 30 منٽن تائين انڪيوبيشن جاري رکو.
3. Centrifugate ردعمل حل.
4. 0.5ml سپرنيٽنٽ وٺو، 2.5ml reagent III، 0.5ml reagent IV شامل ڪريو، چڱيءَ طرح ملايو ۽ 37 ℃ تي انڪيوبيٽ ڪريو30 منٽ لاء.
5. او ڊي660OD طور مقرر ڪيو ويو1؛خالي ڪنٽرول گروپ: 0.5ml reagent V enzyme مٽائڻ لاء استعمال ڪيو ويندو آهيOD جو تعين ڪرڻ جو حل660OD جي طور تي2، ΔOD=OD1-او ڊي2.
6. L-tyrosine معياري وکر: 0.5mL مختلف ڪنسنٽريشن L-tyrosine حل، 2.5mL ريجنٽ III، 0.5mL ريجنٽ IV 5mL سينٽرفيوج ٽيوب ۾، 37 ℃ ۾ 30 منٽ لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو، OD لاءِ پتو لڳايو660L-tyrosine جي مختلف ڪنسنٽريشن لاءِ، پوءِ معياري وکر حاصل ڪيو Y=kX+b، جتي Y آھي L-tyrosine ڪنسنٽريشن، X آھي OD600.
حساب ڪتاب
2: رد عمل جي حل جو ڪل مقدار (ايم ايل)
0.5: اينزيم حل جو مقدار (ايم ايل)
0.5: رد عمل مائع حجم ڪروموجنڪ عزم ۾ استعمال ڪيو ويو (ايم ايل)
10: رد عمل جو وقت (منٽ)
Df: Dilution گھڻن
C: اينزيم ڪنسنٽريشن (mg/mL)
حوالا
1. ويگر يو اينڊ هلز ايڇ ايف بي ايس ليٽ.(1972)؛23:77.
2. ويگر يو اينڊ هلز ايڇ بايوڪيم.بائيوفيس.Res.ڪميون.(1971)؛44:513.
3. هلز، ايڇ.۽ ٻيا.،يورو.جي بايوڪيم.(1975)؛56:103-108.
4. سمبروڪ جيet ال.، ماليڪيولر ڪلوننگ: هڪ ليبارٽري دستياب، ٻيو ايڊيشن، کولڊ اسپرنگ هاربرليبارٽري پريس، سرد بهار هاربر (1989).
انگ اکر
انجير.1 وڌ ۾ وڌ pH
100 ايم ايم بفر حل: pH6.0-8.0، نا-فاسفيٽ؛pH8.0-9.0، Tris-HCl؛pH9.0-12.5، Glycine-NaOH. Enzyme ڪنسنٽريشن: 1mg/mL
تصوير. 2 وڌ ۾ وڌ درجه حرارت
20 ايم ايم ڪ-فاسفيٽ بفر پي ايڇ 8.0 ۾ رد عمل.Enzyme ڪنسنٽريشن: 1 mg/mL
تصوير 3 پي ايڇ استحڪام
25 ℃، 50 ايم ايم بفر حل سان 16 ايڇ-علاج: پي ايڇ 4.5- 5.5، ايڪٽيٽ؛پي ايڇ 6.0-8.0، نا-فاسفيٽ؛pH 8.0-9.0، Tris-ايڇ سي ايل.پي ايڇ 9.0- 12.5، گليسائن-NaOH.Enzyme ڪنسنٽريشن: 1 mg/mL
تصوير 4 حرارتي استحڪام
30 منٽ-علاج 50 ايم ايم ٽريس-HCl بفر سان، پي ايڇ 8.0.Enzyme ڪنسنٽريشن: 1 mg/mL
Fig.5 اسٽوريج استحڪامty at 25 ℃
