RTL Reverse Transscriptase
RTL ريورس ٽرانسڪرپٽ هڪ آر اين اي ٽيمپليٽ تي منحصر ڊي اين اي پوليمريز آهي جنهن ۾ 3'→5' exonuclease سرگرمي نه آهي ۽ RNase H سرگرمي آهي.هي اينزيم آر اين اي کي ٽيمپليٽ طور استعمال ڪري سگھي ٿو ڊي اين اي جي هڪ مڪمل اسٽرينڊ کي ٺهڪائڻ لاءِ، جنهن کي لاڳو ڪري سگهجي ٿو فرسٽ اسٽرينڊ سي ڊي اين اي سنٿيسس، خاص طور تي RT-LAMP (لوپ-ميڊيٽيڊ isothermal amplification) لاءِ.RTL ريورس ٽرانسڪرپٽ 1.0 جي مقابلي ۾، حساسيت خاص طور تي بهتر ٿي چڪي آهي، حرارتي استحڪام مضبوط آهي، ۽ 65 ° C تي ردعمل وڌيڪ مستحڪم آهي.RTL reverse transcriptase (glycerol free) lyophilized تياريون، lyophilized RT-LAMP ريجينٽ وغيره تيار ڪرڻ لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو.
يونٽ جي تعريف
ون يونٽ 1 nmol dTTP کي تيزاب-پريپٽيبل مواد ۾ 20 منٽن ۾ 50°C تي شامل ڪري ٿو پولي(A)•oligo(dT)25 کي ٽيمپليٽ-پرائمر طور استعمال ڪندي.
اجزاء
| جزو | ايڇ سي 5008A-01 | ايڇ سي 5008A-02 | ايڇ سي 5008A-03 |
| RTL Reverse Transscriptase (Glycerol-free) (15U/μL) | 0.1 ايم ايل | 1 ايم ايل | 10 ملي |
| 10×HC RTL بفر | 1.5 ايم ايل | 4 × 1.5 ايم ايل | 5 × 10 ايم ايل |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 ايم ايل | 2 × 1.5 ايم ايل | 3 × 10 ايم ايل |
رکڻ جي حالت
0 ° C کان هيٺ ٽرانسپورٽ ۽ محفوظ ڪيو وڃي -25 ° C ~ -15 ° C.
معيار تي ضابطو
- جي بقايا سرگرميEndonuclease:هڪ 50 μL رد عمل جنهن ۾ 1 μg λDNA ۽ RTL2.0 جا 15 يونٽ 16 ڪلاڪن لاءِ 37 ℃ تي رکيا ويا، اهو ساڳيو نمونو ڏيکاري ٿو جيئن جيل الیکٹروفورسس ذريعي منفي ڪنٽرول.
- جي بقايا سرگرميExonuclease:هڪ 50 μL رد عمل جنهن ۾ 1 μg هند Ⅲ هضم ٿيل λDNA ۽ RTL2.0 جا 15 يونٽ 16 ڪلاڪن لاءِ 37 ℃ تي رکيل آهن، اهو ساڳيو نمونو ڏيکاري ٿو جيئن جيل الیکٹروفورسس ذريعي منفي ڪنٽرول.
- جي بقايا سرگرمينڪاس:هڪ 50 μL رد عمل جنهن ۾ 1 μg سپر ڪولڊ pBR322 ۽ RTL2.0 جا 15 يونٽ 4 ڪلاڪن لاءِ 37°C تي پکڙيل آهن، اهو ساڳيو نمونو ڏيکاري ٿو جيئن جيل الیکٹروفورسس ذريعي منفي ڪنٽرول.
- جي بقايا سرگرميRNase:هڪ 10 μL ردعمل جنهن ۾ 0.48 μg MS2 RNA ۽ RTL2.0 جا 15 يونٽ 4 ڪلاڪن لاءِ 37°C تي پکڙيل آهن اهو ساڳيو نمونو ڏيکاري ٿو جيئن جيل الیکٹروفورسس ذريعي منفي ڪنٽرول.
- اي ڪولي gڊي اين اي:سان ماپيلاي ڪوليمخصوص HCD ڳولڻ واري ڪٽ، RTL2.0 جا 15 يونٽ 1 کان گهٽ آهناي ڪوليجينوم.
رد عمل سيٽ اپ
cDNA Synthesis Protocol
| اجزاء | حجم |
| سانچو RNA a | اختياري |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) يا رينڊم پرائمر ميڪس (60uM) | 2 μL |
| ڊي اين ٽي پي مکس (هر هڪ 10 ايم ايم) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transscriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL بفر | 2 μL |
| نيوڪليس کان پاڪ پاڻي | 20 μL تائين |
نوٽس:
1) ڪل آر اين اي جي تجويز ڪيل دوز 1ng ~ 1μg آهي
2) mRNA جي تجويز ڪيل دوز 50ng ~ 100ng هئي
ٿرمو-معمول لاءِ سائيڪل هلائڻ جا شرط رد عمل:
| گرمي پد (°C) | وقت |
| 25 °Ca | 5 منٽ |
| 55 °C | 10 منٽb |
| 80 °C | 10 منٽ |
نوٽس:
1) جيڪڏهن رينڊم پرائمر ميڪس استعمال ڪيو وڃي، 25 ° C تي هڪ انڪيوبيشن قدم.
2) جيڪڏهن ٽارگيٽ پرائمر ميڪس استعمال ڪيو وڃي، 10 ~ 30 منٽ لاءِ 55 ° C تي انڪيوبيشن قدم.
RT-LAMP پروٽوڪول
| اجزاء | حجم | آخري ڪنسنٽريشن |
| سانچو RNA | اختياري | ≥10 ڪاپيون |
| ڊي اين ٽي پي مکس (10 ايم ايم) | 3.5 μL | 1.4 ايم ايم |
| FIP/BIP پرائمر (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 پرائمر (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| لوپ ايف/لوپ بي پرائمر (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/رد عمل |
| RTL Reverse Transscriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/رد عمل |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 يو / رد عمل |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 μL | 6 ايم ايم (ڪل 8 ايم ايم) |
| 10×HC RTL بفر (يا 10×HC Bst V2 بفر) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| نيوڪليس کان پاڪ پاڻي | 25 μL تائين | - |
نوٽس:
1) گڏ ڪرڻ لاء vortexing ۽ centrifuge مختصر طور تي ملايو.1 ڪلاڪ لاءِ 65 ° C تي مسلسل درجه حرارت انڪيوبيشن.
2) ٻه بفر هڪجهڙائي وارا آهن ۽ هڪجهڙائي آهي.
نوٽس
1. هي پراڊڪٽ هڪ اڇو سڪل بڻجي ويندو جڏهن -20 ° C تي ذخيرو ڪيو ويندو.ان کي ٻاهر ڪڍو -20 ° C کان ۽ برف تي 10 منٽن لاء رکو.پگھلڻ کان پوء، ان کي ڇڪڻ ۽ ملائي استعمال ڪري سگهجي ٿو.
2. سي ڊي اين اي پراڊڪٽ -20 ° C يا -80 ° C تي ذخيرو ٿي سگھي ٿو يا PCR رد عمل لاء فوري طور تي استعمال ڪيو وڃي.
3. RNase آلودگي کي روڪڻ لاء، مهرباني ڪري تجرباتي علائقي کي صاف رکو، ۽ آپريشن دوران صاف دستانو ۽ ماسڪ پائڻ.
