M-MLV Neoscript Reverse Transscriptase
Neoscript Reverse Transcriptase هڪ ريورس ٽرانسڪرپٽ آهي حاصل ڪيل ميوٽيشن اسڪريننگ جي M-MLV جين جي Moloney murine leukemia وائرس جي اصليت ۽ E.coli ۾ اظهار.اينزيم RNase H سرگرمي کي ختم ڪري ٿو، اعلي درجه حرارت جي رواداري آهي، ۽ اعلي درجه حرارت جي ريورس ٽرانسپشن لاء مناسب آهي.تنهن ڪري، اهو آر اين اي جي اعلي سطحي ساخت ۽ غير مخصوص عنصرن جي غير منفي اثرن کي ختم ڪرڻ لاءِ مددگار آهي سي ڊي اين اي جي جوڙجڪ تي، ۽ اعلي استحڪام ۽ ريورس ٽرانسپشن سنٿيسس جي صلاحيت آهي.اينزيم کي اعلي استحڪام ۽ ريورس ٽرانسپشن سنٿيسس جي صلاحيت آهي.
اجزاء
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transscriptase
2.5 × فرسٽ اسٽرينڊ بفر (اختياري)
* 5 × فرسٽ اسٽرينڊ بفر ۾ dNTP شامل نه آهي، مهرباني ڪري رد عمل سسٽم تيار ڪرڻ وقت dNTPs شامل ڪريو
تجويز ڪيل درخواست
1.هڪ قدم qRT-PCR.
2.آر اين اي وائرس جي سڃاڻپ.
رکڻ جي حالت
-20 ° C ڊگھي مدت جي اسٽوريج لاء، استعمال ڪرڻ کان اڳ چڱي طرح ملايو وڃي، بار بار منجمد ٿيڻ کان بچڻ.
يونٽ جي تعريف
ون يونٽ 10 منٽن ۾ 1 nmol dTTP شامل ڪري ٿو 37°C تي پولي(A)•oligo(dT) استعمال ڪندي25جيئن ٽيمپليٽ/پرائمر.
معيار تي ضابطو
1.SDS-PAGE electrophoretic purity 98٪ کان وڌيڪ.
2.امپلائيشن حساسيت، بيچ کان بيچ ڪنٽرول، استحڪام.
3.نڪي خارجي نيوڪليز سرگرمي، نڪي خارجي انڊونيڪليز يا خارجي نڪليز آلودگي
پهرين زنجير رد عمل جي حل لاء رد عمل سيٽ اپ
1.ردعمل مرکب جي تياري
| اجزاء | حجم |
| اوليگو (ڊي ٽي)12-18 پرائمر يا بي ترتيب پرائمرهڪ يا جيني مخصوص پرائمرb | 50 پي ايم ايل |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2pm | |
| 10 ايم ايم ڊي اين ٽي پي | 1 μL |
| سانچو RNA | ڪل RNA≤ 5μg؛mRNA≤ 1 μg |
| RNase آزاد dH2O | 10 μL تائين |
نوٽس:a/b: مھرباني ڪري پنھنجي تجرباتي ضرورتن مطابق مختلف قسم جا پرائمر چونڊيو.
2.5 منٽ لاء 65 ° C تي گرمي ڪريو ۽ 2 منٽن لاء برف تي تيزيء سان ٿڌو.
3.مٿي ڏنل سسٽم ۾ هيٺيون اجزاء شامل ڪريو مجموعي مقدار ۾ 20µL ۽ نرمي سان ملايو:
| اجزاء | حجم (μL) |
| 5 × فرسٽ اسٽرينڊ بفر | 4 |
| Neoscript Reverse Transscriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
| RNase آزاد dH2O | 20 μL تائين |
4. مھرباني ڪري ھيٺ ڏنل شرطن جي مطابق ردعمل انجام ڏيو:
(1) جيڪڏهن رينڊم پرائمر استعمال ڪيو وڃي ٿو، رد عمل 25 ℃ تي 10 منٽ لاء، ۽ پوء 30 ~ 60 منٽ لاء 50 ℃ تي ڪيو وڃي.
(2) جيڪڏهن Oligo dT يا مخصوص پرائمر استعمال ڪيا وڃن، ردعمل کي 30 ~ 60 منٽ لاء 50 ℃ تي ڪيو وڃي.
5.Neoscript Reverse Transcriptase کي غير فعال ڪرڻ ۽ رد عمل کي ختم ڪرڻ لاءِ 5 منٽ لاءِ 95℃ تي گرمي ڪريو.
6.ريورس ٽرانسپشن پراڊڪٽس سڌو استعمال ڪري سگھجن ٿيون پي سي آر ردعمل ۽ فلورسنس مقداري پي سي آر رد عمل ۾، يا ڊگھي وقت تائين -20 ℃ تي ذخيرو ٿيل.
پي سي آر آرعمل:
1.ردعمل مرکب جي تياري
| اجزاء | توجهه |
| 10 × PCR بفر (dNTP مفت، Mg²+ مفت) | 1× |
| dNTPs (10mm هر dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 ايم ايم |
| طاق ڊي اين اي پوليميرس (5U/μL) | 2-2.5 يو |
| پرائمر 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| پرائمر 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| سانچوهڪ | ≤10٪ پهريون زنجير رد عمل حل (2 μL) |
| ڊي ايڇ2O | 50 μL تائين |
نوٽس:الف: جيڪڏهن تمام گهڻو پهريون زنجير ردعمل حل شامل ڪيو ويو آهي، پي سي آر ردعمل کي روڪيو وڃي ٿو.
2.PCR رد عمل جو طريقو
| قدم | گرمي پد | وقت | سائيڪلون |
| اڳواٽ ٺهڻ | 95 ℃ | 2-5 منٽ | 1 |
| رد ڪرڻ | 95 ℃ | 10-20 سيڪنڊ | 30-40 |
| اينيلنگ | 50-60 ℃ | 10-30 سيڪنڊ | |
| واڌارو | 72 ℃ | 10-60 سيڪنڊ |
نوٽس
1.42 ℃ ~ 55 ℃ جي حد ۾ ريورس ٽرانسپشن جي درجه حرارت جي اصلاح لاء مناسب.
2.اهو بهتر استحڪام آهي، اعلي درجه حرارت ريورس ٽرانسپشن امپليڪشن لاء مناسب آهي.ان کان علاوه، اهو آر اين اي جي پيچيده ساختماني علائقن مان موثر طريقي سان گذرڻ لاءِ سازگار آهي.پڻ، اهوهڪ قدم ملٽي پلڪس فلورسنس مقدار جي RT-PCR جي چڪاس لاءِ موزون آهي.
3.مختلف PCR amplification enzymes سان سٺي مطابقت ۽ اعلي حساسيت RT-PCR رد عمل لاء مناسب آهي.
4.مناسب اعلي حساسيت لاءِ هڪ قدم فلوروسينس مقداري RT-PCR رد عمل، مؤثر طريقي سان ٽيمپليٽس جي گهٽ ڪنسنٽريشن جي سڃاڻپ جي شرح کي بهتر بڻائي ٿو.
5.مناسب cDNA لائبريري جي تعمير لاء.
