EndoFree Plasmid Maxi Kit
هي کٽ 150 - 300 ml بيڪٽيريا جي حل مان ڪڍڻ لاءِ موزون آهي رات جو ڪلچر ڪيو ويو، بيڪٽيريا کي ختم ڪرڻ لاءِ بهتر SDS-alkaline lysis طريقو استعمال ڪندي.خام ڪڍڻ کي منتخب طور تي هڪ منفرد Endotoxin Scavenger سان گڏ ڪيو ويو آهي ۽ انڊوٽوڪسين کي هٽائڻ لاء سينٽرفيوگريشن ذريعي الڳ ڪيو ويو آهي.ان کان پوء، سليڪا جيل جھلي چونڊيل طور تي پلاسمڊ ڊي اين اي سان ڳنڍي ٿي حل ۾ اعلي لوڻ ۽ گھٽ پي ايڇ جي حالتن ۾.ان کان پوءِ ڌوئي بفر شامل ڪيو ويندو آهي ته جيئن نجاست ۽ ٻين بيڪٽيريل جزن کي ختم ڪيو وڃي.آخرڪار، هڪ گھٽ لوڻ، اعلي پي ايڇ ايليوشن بفر استعمال ڪيو ويندو آهي خالص پلاسميڊ ڊي اين اي کي سلڪون ميٽرڪس جھلي مان خارج ڪرڻ لاء.سليڪا جيل جھلي خاص جذبي جھلي کي ملازمت ڪري ٿو، ۽ ڪالمن ۽ ڪالمن جي وچ ۾ جذب جي مقدار جو فرق تمام ننڍڙو آھي ۽ ريپٽيبلٽي سٺو آھي.فينول، ڪلوروفارم ۽ ٻين زهريلي ريجنٽ جي ضرورت نه آهي، ۽ نه ئي ايٿانول ورن جي قدمن جي ضرورت آهي.هي کٽ تيزيءَ سان 0.2 -1.5 ملي گرام خالص هاءِ-ڪاپي پلازمڊ ڊي اين اي ڪڍڻ لاءِ استعمال ٿي سگهي ٿي، 80% -90% جي اضافي جي شرح سان.کٽ هڪ منفرد پروسيس فارمولا استعمال ڪري ٿو اينڊوٽوڪسين کي هٽائي ٿو، اينڊوٽوڪسين جو مواد انتهائي گهٽ آهي ۽ سيل جي منتقلي جو اثر شاندار آهي.ڪڍيل پلازميڊ سڌو سنئون اينزيم هضم، پي سي آر، ويٽرو ٽرانسپشن، ٽرانسفارميشن، تسلسل ۽ ٻين ماليڪيولر حياتيات جي تجربن ۾ استعمال ٿي سگهي ٿو.
اسٽوريج حالتون
RNaseA کي ذخيرو ڪيو وڃي -30 ~ -15 ℃ ۽ منتقل ڪيو وڃي ≤0 ℃ تي.
Endotoxin Scavenger هڪ مهيني لاءِ 2 ~ 8 ℃ تي ذخيرو ٿي سگهي ٿو، ڊگھي مدت جي اسٽوريج لاءِ -30 ~ -15 ℃ تي ذخيرو ٿيل۽ ≤0 ℃ تي منتقل ڪيو ويو.
ٻين اجزاء کي ڪمري جي حرارت (15 ~ 25 ℃) تي ذخيرو ڪيو وڃي ۽ ڪمري جي حرارت تي منتقل ڪيو وڃي.
اجزاء
| اجزاء | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| بفر P1 | 75 مليل |
| بفر P2 | 75 مليل |
| بفر P4 | 75 مليل |
| Endotoxin Scavenger | 25 ملي |
| بفر PW | 2 × 22 مليل |
| بفر ٽي بي | 20 مليل |
| فاسٽ پيور ڊي اين اي ميڪسي ڪالمن (هر هڪ 50ml ڪليڪشن ٽيوب ۾) | 10 |
| Endotoxin-مفت جمع ٽيوب | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml، استعمال ڪيو ويو آر اين اي کي ختم ڪرڻ لاء.
بفر P1:بيڪٽيريل معطلي بفر، RNaseA شامل ڪريو بفر P1 ۾ پهرين استعمال کان اڳ.
بفر P2:بيڪٽيريل ليسس بفر (جنهن ۾ SDS/NaOH).
بفر P4:غير جانبدار بفر.
Endotoxin Scavenger:مؤثر طور تي خام پلاسمڊ ڪڍڻ مان endotoxin کي هٽايو.
بفر PW:بفر کي ڌوئڻ، پهرين استعمال کان اڳ ايٿانول جي مقرر ڪيل مقدار شامل ڪريو.
بفر ٽي بي:elution بفر.
فاسٽ پيور ڊي اين اي ميڪسي ڪالمن:پلازميڊ ڊي اين اي جذب ڪندڙ ڪالمن.
جمع ٽيوب 50 ml:فلٽريٽ گڏ ڪرڻ واريون ٽيوبون.
Endotoxin-مفت جمع ٽيوب:پلازميڊ ڊي اين اي گڏ ڪرڻ واريون ٽيوبون.
تيار ڪيل مواد
مطلق ايٿانول، آئوسوپروپنول، 50 مليل گول-بوٽم سينٽريفيوج ٽيوب ۽ 50 مليل اينڊوٽوڪسين-آزادcentrifuge ٽيوب.
درخواستون
هي پراڊڪٽ 150 - 300 مليل بيڪٽيريا حل مان پلازميڊ جي وڏي پيماني تي ڪڍڻ لاءِ موزون آهي.ثقافتي رات جو.
آزمائشي عمل
1. 150 - 200 ml (300 ml کان وڌيڪ نه) بيڪٽيريا جو حل رات جو ڪلچر ڪيو وڃي ۽ سينٽريفيوجاٽڪل 11,000 rpm (12,000 × g) 1 – 2 منٽ لاءِ.سپرنٽنٽ کي رد ڪريو ۽ بيڪرياريا گڏ ڪريو.
Δ 50 ml کان وڌيڪ بيڪٽيريا جي حل کي گڏ ڪرڻ دوران، بيڪٽيريا کي گڏ ڪري سگهجي ٿو بيڪٽيريا جو حل شامل ڪري، سينٽرفيوگريشن، سپرنيٽنٽ کي رد ڪرڻ ۽ ٻين مرحلن لاء ساڳئي 50 ملي ٽيوب ۾.
ڪيترائي ڀيرا.
2. بفر P1 جو 7.5 ml شامل ڪريو (مهرباني ڪري چيڪ ڪريو ته ڇا RNaseA بفر P1 ۾ شامل ڪيو ويو آھي) سينٽريفيوج ۾بيڪٽيريا تي مشتمل ٽيوب ۽ چڱيءَ طرح وورٽيڪس يا پائپنگ ذريعي ملائي.
Δ هن قدم ۾ بيڪٽيريا جي مڪمل بحالي حاصل ڪرڻ لاء اهم آهي، ۽ بحالي کان پوء بيڪٽيريا جي ڪلپس نه هجڻ گهرجي.جيڪڏهن اتي بيڪٽيريا ڪلمپس آهن جيڪي چڱي طرح نه ملايا ويا آهن، اهو ليسس کي متاثر ڪندو، جنهن جي نتيجي ۾ گهٽ پيداوار ۽ پاڪائي.جيڪڏهن بيڪٽيريا جي حل جو OD600 0.65 آهي، اها سفارش ڪئي وئي آهي ته 7.5 ml بفر P1 استعمال ڪيو وڃي جڏهن بيڪٽيريا جي حل جي 150 مليل مان ڪڍيو وڃي.جڏهن OD600 0.75 آهي، بفر P1 جو 8 ml استعمال ڪيو وڃي ۽ بفر P2 ۽ P4 جو حجم ان مطابق تبديل ڪيو وڃي.جيڪڏهن بيڪٽيريا جي حل جو مقدار 200 ml تائين وڌايو وڃي، اهو سفارش آهي تهBuffers P1، P2، ۽ P4 جو مقدار تناسب وڌايو وڃي.
3. بفر P2 جو 7.5 ml بفر P2 شامل ڪريو بيڪٽيريل معطلي ۾ قدم 2 ۽ 6 - 8 لاءِ نرميءَ سان مٿي ۽ هيٺ ملايو.وقت ۽ 4 - 5 منٽ لاء ڪمري جي حرارت تي incubate.
Δ چڱي طرح سان گڏ ڪرڻ لاء آسانيء سان ڦيرايو.وورٽيڪسنگ جينومڪ ڊي اين اي جي ٽڪراءَ جو سبب بڻجندي، جنهن جي نتيجي ۾ نڪتل پلازميڊ ۾ جينومڪ ڊي اين اي جا ٽڪرا پيدا ٿيندا.هن وقت، حل چپس ۽ شفاف ٿي ويندو آهي، اهو ڏيکاري ٿو ته بيڪٽيريا مڪمل طور تي لڪايو ويو آهي.پلاسميڊ جي تباهي کان بچڻ لاء مدت 5 منٽ کان وڌيڪ نه هجڻ گهرجي.جيڪڏهن حل واضح نه آهي، اتي ٿي سگهي ٿو تمام گهڻو بيڪٽيريا جي نتيجي ۾نامڪمل lysis، تنهنڪري بيڪٽيريا جي مقدار کي مناسب طور تي گھٽائڻ گهرجي.
4. بفر P4 جو 7.5 ml جي بفر P4 کي شامل ڪريو 3 قدم کان بيڪٽيريا جي معطلي ۾ ۽ فوري طور تي 6 - 8 ڀيرا آسانيء سان ڦيرايو ته جيئن حل کي مڪمل طور تي بفر P2 کي غير جانبدار ڪرڻ جي اجازت ڏني وڃي.هن وقت، اڇو flocculent precipitate ظاهر ٿيڻ گهرجي.اٽڪل 11,000 rpm (12,000 × g) کان وڌيڪ تي 10 - 15 منٽ لاءِ سينٽريفيوج ڪريو، احتياط سان سپرنيٽنٽ کي نئين 50 ml گول هيٺان سينٽرفيوج ٽيوب (خود تيار ڪيل) ۾ پيپ ڪريو ۽ ان کان پاسو ڪريو.سچل سفيد ورن کي aspirate.
Δ بفر P4 شامل ڪريو ۽ فوري طور تي چڱي طرح گڏ ڪرڻ لاء ڦيرايو.ٽيوب کي بيهڻ لاءِ ڇڏي ڏيو جيستائين اڇو ورن سڄي محلول ۾ برابريءَ سان ورهائجي وڃي ته جيئن مقامي ورن جي پيداوار کي روڪي سگهجي جيڪو غير جانبدار ٿيڻ تي اثر انداز ٿي سگهي ٿو.جيڪڏهن سينٽرفيوگريشن کان اڳ ڪو به يونيفارم سفيد فلوڪولنٽ پريپيٽيٽ نه آهي ۽ سينٽرفيوگريشن کان پوءِ سپرنيٽنٽ صاف نه آهي ته ٽيوب ٿي سگهي ٿو.ٻئي 5 منٽ لاء سينٽرفيوج.
5. Endotoxin Scavenger جو 0. 1 ڀيرا حجم (10٪ سپرنيٽنٽ جي مقدار جو، اٽڪل 2.2 ml) شامل ڪريو سپرنيٽنٽ کي اسٽيپ 4 کان ۽ انورٽ ڪرڻ لاءِ ملايو.محلول کي آئس باٿ ۾ رکو يا 5 منٽ لاءِ ڪچو برف (يا ريفريجريٽر فريزر) ۾ وجھو جيستائين حل turbid کان صاف ۽ شفاف ٿي وڃي (يا اڃا به.ٿورڙو turbid)، ۽ ڪڏهن ڪڏهن ڪيترائي ڀيرا ملايو.
Δ Endotoxin Scavenger کي سپرنيٽنٽ ۾ شامل ڪرڻ کان پوءِ، سپرنيٽنٽ گندو ٿي ويندو پربرفاني غسل ۾ ٿڌي ٿيڻ کان پوءِ سپرنيٽنٽ صاف (يا ٿورڙو turbid) ٿيڻ گهرجي.
6. سپرنيٽنٽ کي ڪمري جي گرمي پد (>25 ℃) تي 10 - 15 منٽ لاءِ رکڻ کان پوءِ، اهو ٿڌڪار ٿي ويندو.ان جو گرمي پد ڪمري جي گرمي تائين وڌي ٿو.پوءِ سپرنيٽنٽ کي ملائڻ لاءِ الٽو ڪيو وڃي.
Δ جيڪڏھن ڪمري جو گرمي پد گھٽ آھي يا توھان ڪڍڻ جو وقت گھٽائڻ چاھيو ٿا، سپرنيٽنٽ کي 37 ~ 42 ℃ واٽر باٿ ۾ 5 - 10 منٽ لاءِ انڪيوبيٽ ڪري سگھجي ٿو ۽ ايندڙ قدم سپرنيٽنٽ کان پوءِ ڪري سگھجي ٿو.گندو ٿي وڃي ٿو.
7. اسٽيج کي الڳ ڪرڻ لاءِ 11,000 rpm (12,000 × g) تي 10 منٽ لاءِ ڪمري جي درجه حرارت تي (درجه حرارت >25 ℃ هجڻ لازمي آهي) تي سينٽرفيوج ڪريو.مٿيون آبي مرحلو ڊي اين اي تي مشتمل هوندو آهي جڏهن ته هيٺين نيري اوائلي مرحلي واري پرت ۾ اينڊوٽوڪسين ۽ ٻيون نجاست شامل هوندي آهي.منتقليڊي اين اي تي مشتمل آبي مرحلو هڪ نئين ٽيوب ڏانهن ۽تيل واري پرت کي ختم ڪريو.
Δ سينٽرفيوگريشن دوران گرمي پد 25 ℃ کان مٿي هجڻ گهرجي جيئن مؤثر مرحلو علحدگي نه آهيٿي سگهي ٿو جيڪڏهن گرمي پد تمام گهٽ آهي.
Δ جيڪڏهن مرحلو علحدگي اثرائتو نه آهي، سينٽرفيوگريشن جي درجه حرارت کي 30 ℃ تائين ترتيب ڏئي سگهجي ٿو ۽سينٽرفيوگريشن جو وقت 15 منٽ تائين وڌائي سگھجي ٿو.
Δ نيري تيل واري پرت کي نه چُسو ڇو ته ان ۾ اينڊوٽوڪسين ۽ ٻيون نجاست شامل آهن.
ميڪانيزم
Resuspension Lysis Neutralization
◇ 7.5 ml بفر P1 شامل ڪريو
◇ 7.5 ml بفر P2 شامل ڪريو
◇ 7.5 ml بفر P4 شامل ڪريو
Endotoxin هٽائڻ
◇ شامل ڪريو 0. 1 ڀيرا Endotoxin Scavenger جي supernatant مقدار
پابند ۽ ڌوئڻ
◇ isopropanol جو مقدار 0.5 ڀيرا شامل ڪريو
◇ 10 ml بفر PW شامل ڪريو
◇ 10 ml بفر PW شامل ڪريو
ايليوشن
◇ شامل ڪريو 1 - 2 ml بفر TB يا Endotoxin-free ddH2O
