ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزيم
ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزائم هڪ ريزومبيننٽ E. coli strain مان نڪتل آهي جيڪو ويڪسينيا ڪيپنگ اينزائم لاءِ جينز کي کڻي ٿو.هي واحد اينزيم ٻن سبونٽس (D1 ۽ D12) تي مشتمل آهي ۽ ان ۾ ٽي اينزيميٽڪ سرگرميون آهن (RNA triphosphatase ۽ guanylyltransferase D1 subunit ۽ Guanine methyltransferase by D12 subunit).ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزائم ڪيپ جي ڍانچي جي ٺهڻ کي متحرڪ ڪرڻ لاءِ اثرائتو آهي، جيڪو خاص طور تي 7-ميٿيل گوانائليٽ ڪيپ جي جوڙجڪ (m7Gppp، Cap 0) کي RNA جي 5′ پڇاڙيءَ سان ڳنڍي سگھي ٿو.ڪيپ جي جوڙجڪ (ڪيپ 0) ايم آر اين اي جي استحڪام، ٽرانسپورٽ ۽ يوڪريوٽس ۾ ترجمي ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿي.اينزيميٽڪ ريڪشن ذريعي آر اين اي کي ڪيپ ڪرڻ هڪ مؤثر ۽ سادو طريقو آهي جيڪو ان ويٽرو ٽرانسڪرپشن، ٽرانسفيشن ۽ مائڪرو انجيڪشن لاءِ آر اين اي جي استحڪام ۽ ترجمي کي خاص طور تي بهتر ڪري سگهي ٿو.
اجزاء
ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزائم (10 U/μL)
10 × ڪيپنگ بفر
اسٽوريج حالتون
اسٽوريج لاءِ -25～- 15℃
اسٽوريج بفر
20 ايم ايم ٽريس-ايڇ سي ايل (پي ايڇ 8.0)، 100 ايم ايم اين سي ايل،
1mm DTT، 0. 1mm EDTA، 0. 1% Triton X- 100، 50% glycerol.
يونٽ جي تعريف
ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزائم جي هڪ يونٽ کي 37 ڊگري سينٽي گريڊ تي 1 ڪلاڪ ۾ GTP جي 10pmol کي 80nt ٽرانسڪرپٽ ۾ شامل ڪرڻ لاءِ گهربل اينزيم جي مقدار طور بيان ڪيو ويو آهي.
معيار تي ضابطو
Exonuclease:10U جو ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزائم 1μg λ-Hind III ڊائجسٽ DNA سان 37 ℃ تي 16 ڪلاڪن تائين ڪا به خرابي پيدا نه ڪندو آهي جيئن ايگرز جيل الیکٹروفورسس پاران طئي ڪيو ويو آهي.
Endonuclease:10U جو ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزائم 1μg λDNA سان 37℃ تي 16 ڪلاڪن لاءِ ڪا به خرابي پيدا نه ڪندو آهي جيئن ايگرز جيل اليڪٽرروفورسس پاران طئي ٿيل آهي.
نڪاس:ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزائم جو 10U 1 μg pBR322 سان 37 ℃ تي 16 ڪلاڪن لاءِ ڪا به خرابي پيدا نه ڪندو آهي جيئن ايگرز جيل الیکٹروفورسس پاران طئي ٿيل آهي.
RNase:10U جو ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزائم 1.6μg MS2 RNA سان 4 ڪلاڪن لاءِ 37℃ تي ڪا به خرابي پيدا نه ٿيندي جيئن ايگرز جيل الیکٹروفورسس پاران طئي ٿيل آهي.
1.ڪولي ڊي اين اي:ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزائم جو 10U E. coli genomic DNA جي موجودگي لاءِ اسڪريننگ ڪيو ويو آهي TaqMan qPCR استعمال ڪندي پرائمر سان E. coli 16S rRNA لوڪس لاءِ مخصوص.E. coli genomic DNA آلودگي ≤1 E. coli جينوم آهي.
2.بيڪٽيريا Endotoxin: LAL-ٽيسٽ، چيني فارماڪوپيا IV 2020 ايڊيشن جي مطابق، جيل حد ٽيسٽ جو طريقو، عام اصول (1143).بيڪٽيريل اينڊوٽوڪسين جو مواد هجڻ گهرجي ≤10 EU/mg.
رد عمل جو نظام ۽ حالتون
1. ڪيپنگ پروٽوڪول (رد عمل جي مقدار: 20 μL)
اهو طريقو 10μg RNA (≥100 nt) جي ڪيپنگ ردعمل تي لاڳو ٿئي ٿو ۽ ان کي تجرباتي مطالبن جي مطابق ماپ ڪري سگهجي ٿو.
I) 10μg RNA ۽ Nuclease-free H2O کي 1.5 ml مائڪروفيوج ٽيوب ۾ 15.0 µL جي آخري حجم تائين گڏ ڪريو.*10×ڪيپنگ بفر: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) 5 منٽن لاءِ 65 ℃ تي گرمي ڪريو ۽ پوءِ 5 منٽن لاءِ آئس باٿ ڪريو.
3) ڏنل ترتيب ۾ ڏنل اجزاء شامل ڪريو
| Cمددگار | Vاولوم |
| رد ٿيل آر اين اي (≤10μg، length≥100 nt) | 15 μL |
| 10 × ڪيپنگ بفر * | 2 μL |
| جي ٽي پي (10 ايم ايم) | 1 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزيم (10U/μL) | 1 μL |
*10 × ڪيپنگ بفر: 0.5 ايم ٽريس-ايڇ سي ايل، 50 ايم ايم ڪي سي ايل، 10 ايم ايم ايم سي ايل 2، 10 ايم ايم ڊي ٽي ٽي، (25℃، pH8.0)
4) 37 ° C تي 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو، آر اين اي ھاڻي بند ٿيل آھي ۽ ھيٺئين حصي جي ايپليڪيشنن لاءِ تيار آھي.
2. 5′ ٽرمينل ليبلنگ جو ردعمل (رد عمل جو مقدار: 20 μL)
هي پروٽوڪول آر اين اي کي ليبل ڪرڻ لاءِ ٺاهيو ويو آهي جنهن ۾ 5´ ٽرائيفاسفيٽ شامل آهي ۽ ان کي مطالبن جي مطابق ماپ ڪري سگهجي ٿو.ليبل شامل ڪرڻ جي ڪارڪردگي تي اثر ٿيندو آر اين اي جي دالر تناسب: GTP، انهي سان گڏ RNA نموني ۾ GTP مواد.
1) RNA ۽ Nuclease-free H2O جي مناسب مقدار کي 1.5 ml microfuge ٽيوب ۾ 14.0 µL جي آخري مقدار ۾ گڏ ڪريو.
2) 5 منٽن لاءِ 65 ℃ تي گرمي ڪريو ۽ پوءِ 5 منٽن لاءِ آئس باٿ ڪريو.
3) ھيٺ ڏنل اجزاء شامل ڪريو بيان ڪيل ترتيب ۾.
| Cمددگار | Vاولوم |
| رد ٿيل آر اين اي | 14 μL |
| 10 × ڪيپنگ بفر | 2 μL |
| GTP مرکب** | 2 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| ويڪسينيا وائرس ڪيپنگ اينزيم (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX GTP ڏانهن اشارو ڪري ٿو ۽ نشانن جو ننڍڙو تعداد.GTP جي ڪنسنٽريشن لاءِ، حوالو ڏيونوٽ ڪرڻ لاء 3.
4) 37 ° C تي 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو، RNA 5′ آخر هاڻي ليبل ٿيل آهي ۽ هيٺ لهڻ لاءِ تيار آهي.
درخواستون
1. ڪيپنگ mRNA کان اڳ ترجمي جي assays/in vitro translation
2. mRNA جي 5' پڇاڙيءَ کي ليبل ڪرڻ
استعمال تي نوٽس
1.ويڪسينيا ڪيپنگ اينزائم سان انڪيوبيشن کان اڳ آر اين اي جي حل کي گرم ڪرڻ سان ٽرانسڪرپٽ جي 5'آخر تي ثانوي ڍانچي ختم ٿي ويندي آهي.وقت وڌايو 60 منٽن تائين ٽرانسڪرپٽس لاءِ سڃاتل انتهائي منظم 5'ends سان.
2. ڪيپنگ رد عمل لاءِ استعمال ٿيندڙ آر اين اي کي استعمال ڪرڻ کان اڳ صاف ڪيو وڃي ۽ نيوڪليز کان خالي پاڻي ۾ معطل ڪيو وڃي.EDTA موجود نه هجڻ گهرجي ۽ حل لوڻ کان پاڪ هجڻ گهرجي.
3. 5´ آخر کي ليبل ڪرڻ لاءِ، ڪل GTP ڪنسنٽريشن 1-3 ڀيرا هجڻ گهرجي رد عمل ۾ mRNA جي دالر ڪنسنٽريشن کان.
4. رد عمل سسٽم جو مقدار حقيقي مطابق مٿي يا ھيٺ ڪري سگھجي ٿو.
