هاء-پيداوار T7 ويٽرو ٽرانسپشن ريجينٽ ۾ (Thermostable)

اجزاء

اسٽوريج حالتون

0 °C هيٺ ٽرانسپورٽ ۽ اسٽوريج -25～-15°C تي.

پروٽوڪول

• ڊي اين اي ٽيمپليٽ تيار ڪرڻ

لڪيرايل پلازميڊ ڊي اين اي، پي سي آر پروڊڪٽس يا مصنوعي ڊي اين اي اوليگونوڪليوٽائڊس استعمال ڪري سگھجن ٿيون ٽيمپليٽس لاءِ ان ويٽرو ٽرانسڪرپشن لاءِ کٽ سان. ڊي اين اي ٽيمپليٽ کي TE بفر يا RNase-free ddH2O ۾ ٽوڙي سگھجي ٿو.

•پلاسميڊ ٽيمپليٽس: لڪيرايل پلاسمڊ ۾ لازمي طور تي T7 پروموٽر علائقو DNA ٽيمپليٽ هجڻ گهرجي.لڪيرايل پلاسمڊ جي معيار آر اين اي جي پيداوار ۽ سالميت کي متاثر ڪري ٿو.ڪٽ جي ڪامياب استعمال لاءِ تمام گهڻي لڪير واري پلاسميڊ ٽيمپليٽ تمام ضروري آهي ڇاڪاڻ ته سرڪيولر پلازميڊ کي مؤثر طريقي سان ختم نه ڪيو ويو آهي.سڀ کان وڌيڪ ٽرانسڪرپشن جي پيداوار حاصل ڪئي وئي آهي اعلي ترين خالص ٽيمپليٽ سان.آر اين اي ٽرانسڪرپٽ تيار ڪرڻ لاءِ هڪ مقرر ٿيل ڊگھي، پلازمڊ ڊي اين اي کي مڪمل طور تي هڪ پابندي واري اينزيم سان لڪيرائڻ گهرجي جيڪو بلنٽ ختم يا 5'-اوور هينگس ٺاهي ٿو.ليبارٽري جي طريقن سان صاف ڪيل لڪيرائيز پلاسمڊ RNase، پروٽين، RNA ۽ لوڻ کي آلودگي کان آزاد ٿي سگهي ٿو.

• PCR ٽيمپليٽ: PCR پروڊڪٽس تي مشتمل T7 RNA پوليمريز پروموٽر صحيح رخ ۾ نقل ڪري سگھجي ٿو.صاف ڪيل پي سي آر جي شين سان بهتر پيداوار حاصل ڪئي ويندي، جيتوڻيڪ پي سي آر مرکب سڌو سنئون استعمال ڪري سگهجي ٿو.

• مصنوعي ڊي اين اي اوليگنucleotides:مصنوعي DNA oligonucleotides جيڪي يا ته مڪمل طور تي ڊبل اسٽينڊ ٿيل آهن يا گهڻو ڪري سنگل اسٽرينڊ آهن جن کي ڊبل اسٽرينڊ T7 پروموٽر تسلسل سان نقل ڪري سگهجي ٿو.

آر اين اي سنٿيسس پروٽوڪول

RNase جي آلودگي کان بچڻ لاءِ دستانو پائڻ ۽ نيوڪليز فري ٽيوب ۽ ريجنٽ استعمال ڪرڻ جي سخت سفارش ڪئي وئي آهي.ننڍي مقدار جي ردعمل کي نيوڪليز فري مائڪروفيوج ٽيوب يا پي سي آر پٽي ٽيوب ۾ گڏ ڪيو وڃي.

روايتي آر اين اي سنٿيسس

1. ڪٽ جي ضروري حصن کي ٿڪايو، مائڪرو فيوج ۾ ملايو ۽ پلس اسپن ڪريو ته جيئن ٽيوب جي ھيٺان حل گڏ ڪري سگھجي.برف تي رکو.

2. جيڪڏهن توهان ڪيترن ئي رد عملن کي هلائڻ جي منصوبابندي ڪري رهيا آهيو، اهو آسان آهي ته 10 × هاءِ يئلڊ IVT بفر ۽ چار رائبونيڪلوٽائيڊ (NTP) حلن جي برابر مقدار کي گڏ ڪري هڪ ماسٽر ميڪس تيار ڪرڻ.استعمال ڪريو 10 μl ماسٽر ميڪس في ردعمل.

3. هيٺين ترتيب ۾ ڪمري جي حرارت تي ردعمل کي گڏ ڪريو:

* پراڊڪٽ جي مدافعتي صلاحيت کي گھٽائڻ لاءِ، UTP کي ساڳئي آخري ڪنسنٽريشن تي N1-Me-pUTP سان تبديل ڪري سگھجي ٿو.

4. چڱي طرح ملايو، پلس-اسپن مائڪروفيوج ۾.37 ° C تي 2 ڪلاڪن لاءِ، يا 50 ° C تي 1 ڪلاڪ لاءِ، جيڪڏھن تيز گرمي پد جي رد عمل جي ضرورت آھي.

5. ڊي اين اي هضم: ٽيمپليٽ ڊي اين اي کي هٽائڻ لاءِ، هر 20 μL ردعمل ۾ DNase I جو 10U شامل ڪريو، چڱي طرح ملايو ۽ 37 سينٽي گريڊ تي 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو.

ڪيپ ٿيل آر اين اي سنٿيسس

ساڳيو پروٽوڪول روايتي آر اين اي جي جوڙجڪ سان، رد عمل کي گڏ ڪرڻ جي قدم کان سواء.هيٺ ڏنل ترتيب ۾ ڪمري جي حرارت تي ڪيپ ٿيل آر اين اي سنٿيسس جي رد عمل کي گڏ ڪريو:

*** جيڪڏهن گهربل هجي، Cap1(3'OH AG) ۽ cap1(3'OMe AG) استعمال ڪري سگھجن ٿا ascap اينالاگ.اسان جي Co-Transcription reagent Co-capping T7 invitro ٽرانسپشن ريجينٽ (pUTP، CAP GAG (3'OMe)، pUTP، CAP GAG، N1-Me-pUTP، CAP GAG (3'OMe) ۽ N1-Me-pUTP، CAP گيگ.

mRNA صاف ڪرڻ

• فينول: ڪلوروفارم اضافيعمل ۽ ايٿانول ورن

پروٽين ۽ اڪثر مفت نيوڪليوٽائڊس کي ختم ڪرڻ لاءِ، فينول: ڪلوروفارم ڪڍڻ ۽ آر اين اي ٽرانسڪرپشن جي ايٿانول ورن کي ترجيح ڏيڻ جو طريقو آهي.

1. رد عمل جي مقدار کي 180 μL تي ترتيب ڏيو 160 μL نيوڪليز کان پاڪ پاڻي شامل ڪندي.شامل ڪريو 20 μL جو 3M سوڊيم ايڪٽيٽ، pH5.2، چڱي طرح ملايو.

2. 1:1 فينول/ ڪلوروفارم جي برابر مقدار سان ڪڍو، سينٽرفيوج 10000 rpm تي 5 منٽن لاءِ.پاڻي واري مرحلي کي گڏ ڪريو ۽ نئين ٽيوب ڏانهن منتقل ڪريو.

3. ڪلوروفارم جي برابر مقدار سان ٻن اضافين جي پٺيان.پاڻي واري مرحلي کي گڏ ڪريو ۽ نئين ٽيوب ڏانهن منتقل ڪريو.

4. آر اين اي ايٿانول جي 2 جلدن سان ڀريل هئي.گهٽ ۾ گهٽ 30 منٽن لاءِ -20 ℃ تي رکو، ۽ 15 منٽن لاءِ سينٽرفيوگريشن ذريعي پيلٽ گڏ ڪريو.احتياط سان سپرنٽنٽ کي هٽايو.

5. پيلٽ کي 150 μL ~ 200 μL ٿڌي 70٪ ايٿانول سان ڌوء.

6. پيلٽ کي 2 منٽن لاءِ هوا ۾ سڪي ڇڏيو ۽ 100 μL~200 μL RNase-free پاڻي يا ٻين بفرن ۾ ٻيهر بند ڪريو.

• LiCl ورن

آر اين اي جي LiCl ورن اڪثريت کي ختم ڪرڻ ۾ اثرائتو آهي غير منظم ٿيل NTPs ۽ اينزيمس.

1. LiCl حل (5M) جي برابر مقدار شامل ڪريو، چڱي طرح ملايو.

2. گهٽ ۾ گهٽ 30 منٽ لاء -20 ℃ تي incubate.12000 rpm تي 4℃ تي سينٽرفيوج 15 منٽن لاءِ pallet RNA.احتياط سان سپرنٽنٽ کي هٽايو.

3. 200 μL precooling 70% ethanol شامل ڪري pallet resin.ايٿانول کي احتياط سان هٽايو.2 ~ 3 ڀيرا لاء قدمن کي ورجايو.

4. پيلٽ کي 5~10 منٽن لاءِ هوا ۾ خشڪ ڪريو ۽ 100 μL ~ 200 μL RNase-free پاڻي يا ٻين بفرن ۾ ٻيهر سڪايو.

• اسپن ڪالمن جي صفائي

اسپين ڪالمن کي غير منظم ٿيل اين ٽي پيز، پروٽين ۽ لوڻ کي ختم ڪري ڇڏيندو.

• مقناطيسي مالا پوريافسانوي

مقناطيسي مالا صاف ڪري سگھي ٿو اڻڄاتل نيوڪليوٽائيڊس، پروٽين ۽ لوڻ کي ختم ڪري ٿو.

رد عمل جي شين جي مقدار

• quantification by UV روشني جذب: رد عمل جي شين کي صاف ڪرڻ جي ضرورت آهي ڇو ته رد عمل جي مرکب ۾ ڪنهن به غير شامل ڪيل نيوڪليوٽائيڊس ۽ ٽيمپليٽ ڊي اين اي پڙهڻ تي اثر انداز ڪندا.260 nm تي UV spectrophotometry کي ماپڻ آساني سان RNA ڪنسنٽريشن حاصل ڪري سگھي ٿو.سنگل اسٽرينڊڊ آر اين اي لاءِ، 1 A260 40 μg/mL جي RNA ڪنسنٽريشن سان مطابقت رکي ٿو.

• مقدار by رنگڻ: رد عمل جي شين جي مقدار کي صاف ڪرڻ کان سواء ربو گرين رنگ سان استعمال ڪري سگهجي ٿو، ڇاڪاڻ ته غير شامل ڪيل نيوڪليوٽائڊس آر اين اي شين جي تشخيص تي اثر انداز نه ڪندا.

نوٽس

• ٽرانسڪرپشن رد عمل RNase-آزاد ماحول ۾ ٿيڻ گهرجي.دستانو پائڻ جي صلاح ڏني وئي آهي.ٽوپيون، نلڪيون ۽ پاڻي nuclease آزاد هجڻ گهرجي.

• NTPs جو تمام بھترين حتمي ڪنسنٽريشن 10 mM آھي، ۽ توھان NTPs جي آخري ڪنسنٽريشن کي حقيقي حالت موجب تبديل ڪري سگھو ٿا.

• RNA synthesis Reaction mixture ڪمري جي گرمي پد تي تيار ڪيو وڃي، ڇاڪاڻ ته DNA 4°C تي اسپرميڊين جي موجودگيءَ ۾ تيز ٿي سگهي ٿو.

• مناسب ڊگھائي ٽرانسڪرپٽس جي پيداوار گھٽجي ٿي جيڪڏھن ٽيمپليٽ ڊي اين اي نامڪمل طور تي لڪير ٿيل آھي.

• رد عمل جو مرکب مٿي يا هيٺ ڪري سگهجي ٿو.

• بفر کي ملايو جيستائين ناقابل حل مادو استعمال ڪرڻ کان اڳ مڪمل طور تي حل ٿي وڃي، جيڪڏهن بفر کي ڳولهڻ کان پوءِ ان ۾ حل نه ٿيندڙ مادو مليو.

• 300 bp کان ننڍو ٽرانسڪرپشن سان رد عمل لاء، 37 ℃ تي 4-8 ڪلاڪ انڪيوبيشن توهان کي وڌيڪ پيداوار ڏيڻ گهرجي.

• معياري RNA سنٿيسس ٽرانسڪرپٽس لاءِ استعمال ٿيندڙ ڊي اين اي ٽيمپليٽ ۾ T7 پروموٽر سيڪيونس شامل ٿيڻ گھرجي جنھن جي پٺيان GGG شروعاتي تسلسل، ڇاڪاڻ ته T7 RNA پوليمريز کي GTP سان وڌيڪ لاڳاپو آھي.

• co-transscription سسٽم سان mRNA سنٿيسس لاءِ استعمال ٿيندڙ ڊي اين اي ٽيمپليٽ ۾ T7 پروموٽر تسلسل شامل هجڻ گهرجي جنهن جي پٺيان AGG شروعات جي ترتيب هجي.

مشڪلاتون

a) مڪمل-لين جي گھٽ پيداوارgth RNA:

جيڪڏهن ٽرانسڪرپشن جو رد عمل مڪمل ڊگھي آر اين اي ٺاهي ٿو، پر پيداوار توقع کان تمام گهٽ آهي، اهو ممڪن آهي ته ڊي اين اي ٽيمپليٽ ۾ آلودگي آر اين اي پوليميريز کي روڪي رهيا آهن، يا ڊي اين اي ڪنسنٽريشن تمام گهٽ يا غلط هجي.

تجويز: ڊي اين اي ٽيمپليٽ جي اضافي صفائي جي سفارش ڪئي وئي آهي.

b) آر اين اي نقل تي smearing دنپيشاب ڪرڻ جيل:

جيڪڏهن آر اين اي ايگرز يا پوليڪريلامائيڊ جيل کي ختم ڪرڻ تي خراب ٿئي ٿي، ته ڊي اين اي ٽيمپليٽ يا تجرباتي عمل RNase سان آلوده آهي.

تجويز: جيڪڏهن پلازمڊ ڊي اين اي ٽيمپليٽ RNase سان آلوده آهي، فينول / ڪلوروفارم ڪڍڻ ۽ ايٿانول پريپيٽيٽ انجام ڏيو.تجربا دوران استعمال ٿيل اشارا ۽ ٽيوبون RNase-آزاد آهن.مهرباني ڪري ليب ڪوٽ، ماسڪ ۽ ڊسپوزيبل دستانو پائڻ.

ج) آر اين اي جو نقل توقع کان وڏي سائيز:

جيڪڏهن آر اين اي ٽرانسڪرپٽ ڊيناچرنگ جيل تي توقع کان وڏي نظر اچي ٿي، ٽيمپليٽ پلازمڊ ڊي اين اي ناممڪن طور تي هضم ٿي سگھي ٿو.مضبوط ثانوي اڏاوتن جي موجودگي سبب ٿي سگھي ٿو RNA ٽرانسڪرپٽ مڪمل طور تي رد نه ڪيو ويو.

تجويز: مڪمل هاضمي لاءِ ٽيمپليٽ چيڪ ڪريو، جيڪڏهن اڻ هضم ٿيل پلازميڊ جي تصديق ٿئي ٿي، ٻيهر پابندي اينزائم هضم کي ورجايو.ڊي اين اي ٽيمپليٽ جي ثانوي ڍانچي کي ترتيب ڏيڻ جي مرحلي ۾ گھٽايو.

d) آر اين اي نقل جو ننڍو ماپ کان متوقع:

جيڪڏهن جيل جي تجزيي کي رد ڪري ٿو ته متوقع سائيز کان ننڍڙن بينڊن جي موجودگي کي ظاهر ڪري ٿو، اهو سڀ کان وڌيڪ ممڪن آهي پوليميرس طرفان وقت کان اڳ ختم ٿيڻ جي ڪري.ڪجھ سلسلو جيڪي T7 RNA پوليمريز جي ختم ٿيڻ جي سگنلن سان مشابهت رکن ٿا وقت کان اڳ ختم ٿي ويندا.

تجويز: ٽرانسڪرپشن جي رد عمل کي گھٽ درجه حرارت تي، مثال طور 30 ​​° C تي، مڪمل ڊگھي ٽرانسڪرپٽ جو تناسب وڌائي سگھي ٿو، پر پيداوار گھٽجي ويندي.GC رچ ٽيمپليٽس لاءِ، يا ثانوي ڍانچي سان گڏ ٽيمپليٽس، 42°C تي انڪيوبيشن مڪمل ڊگھي ٽرانسڪرپٽ جي پيداوار کي بهتر بڻائي سگھي ٿي.