Rnase assay Kit (fluorescence)
RNase ڳولڻ واري ڪٽ هڪ فلوروفور-ليبل ٿيل آر اين اي پروب تي ٻڌل آهي.جڏهن نموني ۾ RNase سرگرمي شامل ناهي، تحقيق مستحڪم آهي ۽ فلورسنٽ سگنل پيدا نٿو ڪري.جڏهن نمونو RNase سرگرمي تي مشتمل آهي، تحقيق خراب ٿي ويندي آهي، نتيجي ۾ هڪ بتدريج وڌايو ويو فلورسنس سگنل؛fluorescence سگنل ۾ واڌ جي شرح مثبت طور تي اينزيميمس جي تعداد ۽ سرگرمي سان لاڳاپيل آهي.ex/em=535/575nm جي wavelength تي ماپڻ لاءِ فلورسنس مائڪروپليٽ ريڊر استعمال ڪريو اهو معلوم ڪرڻ لاءِ ته ڇا نمونو RNase کان آلوده آهي.
درخواست
هي کٽ نموني ۾ RNase آلودگي کي ڳولڻ لاء استعمال ڪيو ويندو آهي.
Cاجزاء
| نالو | HCP0035A-01 (192T) | HCP0035A-02 (48T) |
| 10 × ردعمل حل | 2.0 ايم ايل | 0.5 ملي ليٽر |
| آر اين اي جاچ | 1 ٽيوب | 1 ٽيوب |
| TE بفر | 2.0 ايم ايل | 0.5 ملي ليٽر |
| RNase A معياري (10mg/mL) | 20μL | 10μL |
| معياري Dilution بفر | 12 ملي ليٽر | 6 ايم ايل |
| DNase ۽ RNase آزاد پاڻي | 25 ملي ليٽر | 25 ملي ليٽر |
| DNase RNase پري | 50 ملي ليٽر | 50 ملي ليٽر |
اسٽوريج ۽ استحڪام
1. -25 ~ - 15 ℃ ۾ ٽرانسپورٽ؛
2.ڪٽ جي مختلف حصن کي الڳ الڳ محفوظ ڪيو ويو آهي درجه حرارت جي مطابق:
| نالو | گرمي پد |
| 10 × ردعمل حل | -25 ~ - 15 ℃ |
| آر اين اي جاچ | -25 ~ - 15 ℃ |
| TE بفر | -25 ~ - 15 ℃ |
| RNase A معياري (10mg/mL) | -25 ~ - 15 ℃ |
| معياري Dilution بفر | -25 ~ - 15 ℃ |
| DNase ۽ RNase آزاد پاڻي | -25 ~ 30 ℃ |
| DNase RNase پري | 2 ~ 30 ℃ |
3. اڻ کليل کٽ کي 12 مهينن تائين ذخيرو ڪريو.
4.کٽ کي کولڻ کان پوءِ 6 مهينن تائين ذخيرو ڪريو.اها سفارش ڪئي وئي آهي ته آر اين اي پروب حل کي هڪ واحد استعمال جي مقدار مطابق aliquot ڪيو وڃي ته جيئن روشني ۽ بار بار منجمد ۽ پگھلڻ کان بچڻ لاءِ.
گهربل سامان ۽ استعمال جون شيون
1.فلورسنس مائڪروپليٽ ريڊر (بشمول ex/em=535/575nm wavelength)
2. DNase ۽ RNase-مفت پائپيٽ ۽ ٽوٽڪا
3. DNase ۽ RNase-مفت EP ٽيوب
4. DNase ۽ RNase-آزاد ڪارو غير شفاف 96-ويل پليٽ
Reagent جي تياري
1.کٽ کي ٻاهر ڪڍو ۽ ڪمري جي حرارت (18~25 ℃) تي برابر ڪريو، حصن کي ڇڪيو ۽ ملايو جيئن 10× ردعمل حل، TE بفر، RNase A معياري (10mg/mL)، معياري Dilution Buffer، ۽ پوءِ فوري طور تي سينٽريفيوج.(10 سيڪنڊن لاءِ 4000~7000rpm تي سينٽرفيوج).
2. آر اين اي پروب کي 4000~7000rpm تي 60 سيڪنڊن لاءِ سينٽريفيوج ڪريو ان کي ٽيوب جي تري ۾ گڏ ڪرڻ لاءِ، احتياط سان ٽيوب ڪيپ کي کوليو، ۽ 40μL TE بفر شامل ڪريو جيئن ٽوڙڻ لاءِ آر اين اي پروب اسٽوريج حل، آر اين اي پروب اسٽوريج حل جي مطابق هڪ ئي استعمال جي رقم تائين ۽ انهن کي -25 ~ -15 ° C تي ذخيرو ڪريو ته جيئن بار بار منجمد ٿيڻ ۽ پگھلڻ کان بچڻ لاءِ.هر دفعي پروب اسٽوريج حل ڪڍيو جڏهن توهان ٽيسٽ ڪريو، ان کي 50 ڀيرا TE بفر سان ملايو (مثال طور، 490μL TE بفر کي 12μL RNA پروب ۾ شامل ڪريو) جيئن RNA پروب ڪم ڪندڙ حل.باقي آر اين اي پروب ڪم ڪندڙ حل کي محفوظ ڪريو -25 ~ -15 ° سي تي روشني ۽ بار بار منجمد ٿيڻ ۽ پگھلڻ کان بچڻ لاءِ.
تشخيص جا قدم
1. پهرين ٽيسٽ کان اڳ مناسب فائدو مقرر ڪرڻ لاء قدم، حساسيت جي نقصان جي خطري کان بچڻ يا سگنل جي اوور سيچريشن.
1) اوزار جي ماپ:
ڳولهڻ کان اڳ ڇڪڻ واري پليٽ 10 ~ 15s؛
حوصلي جي موج جي ڊيگهه λEx = 535nm؛
اخراج موج جي ڊيگهه λEm = 575nm؛
خودڪار حاصل فنڪشن استعمال ڪريو؛
گرمي پد 37 ℃؛
آخر پوائنٽ موڊ.
حاصل کي سيٽ ڪريو خودڪار پيماني تي جيڪڏهن ممڪن هجي، متبادل طور تي استعمال ڪريو وچولي حاصل سيٽنگ شروعاتي طور تي.
نوٽ: مختلف آلات جي سيٽنگ جو طريقو هڪجهڙائي نه آهي، مهرباني ڪري تفصيل لاء اوزار فراهم ڪندڙ سان صلاح ڪريو.
2) 96-ڪھڙي پليٽ تي 2 کوھ چونڊيو، 10μL آر اين اي پروب ڪم ڪندڙ حل ۽ 10μL 10× رد عمل جو حل شامل ڪريو.
3) هڪ کوهه ۾ 80μL DNase ۽ RNase-free پاڻي شامل ڪريو، ۽ ٻئي کوهه ۾ 79μL DNase&RNase-free پاڻي ۽ 1μL RNase A معياري (100mg/mL) شامل ڪريو.
4) پليٽ کي 37 ° C تي اونداهي جاءِ تي رکو ۽ 30 منٽن کان پوءِ ان کي آزمايو.
5) جيڪڏهن حاصل کي آٽو اسڪيل تي سيٽ ڪيو وڃي، حاصل ڪيل قيمت ڊيٽا فائل جي اوزار جي پيٽرولر بار ۾ ڏيکاري ويندي، G1 طور ظاهر ڪيو ويو آهي.
6) شروعاتي طور تي وچولي حاصل ڪرڻ واري سيٽنگ کي استعمال ڪندي، اهو ياد رکڻ گهرجي ته: جيڪڏهن اعلي فلوروسينس قيمت اوزار جي مٿين حد کان وڌي ٿي، فائدي جي قيمت کي مناسب طور تي گھٽائڻ گهرجي؛جيڪڏهن اعلي فلوروسنس قيمت اوزار جي مٿين حد کان تمام گهڻو هيٺ آهي، حاصل جي قيمت مناسب طور تي وڌايو وڃي.آخرڪار، مناسب فائدي جي قيمت حاصل ڪئي وئي، G2 طور بيان ڪيو ويو آھي.
2. ايس۽ اوزار جي ماپ:
ڳولهڻ کان اڳ ڇڪڻ واري پليٽ 10 ~ 15s؛
حوصلي واري موج λEx=485nm؛
اخراج موج جي ڊيگهه λEm = 525nm؛
G1 يا G2 کي حاصل ڪيل قيمت سيٽ ڪريو قدم 1 ۾ حاصل ڪيو؛
گرمي پد 37 ℃؛
جيڪڏهن مائڪروپليٽ ريڊر ڪائنيٽيڪل موڊ کي سپورٽ ڪري ٿو، ته اها صلاح ڏني وئي آهي ته ڪائنيٽيڪ ڊيٽڪشن موڊ استعمال ڪيو وڃي، 1 کان 1.5 منٽن جي وقفي سان، ۽ ڪل وقت 30 منٽ آهي.
3.نموني تيار ڪرڻ
تجويز ڪيل نموني حجم 80μL آهي.جيڪڏهن ٽيسٽ ڪيو وڃي ته نمونو 80μL کان گهٽ آهي، DNase ۽ RNase-مفت پاڻي سان 80μL کي ملائي.
جڏهن نموني کي جانچيو وڃي ٿو ته اهي شيون شامل آهن جيڪي فلوروفور جي روشني کي متاثر ڪن ٿا (جهڙوڪ ڳاڙهو محلول، تيز ڪنسنٽريشن ويسڪ مادو يا سرفڪٽيٽ)، نموني کي DNase ۽ RNase آزاد پاڻي سان ٺهڪيو وڃي، پر مهرباني ڪري نوٽ ڪريو ته ڊيلشن آپريشن تي اثر پوندو. حساسيت.نموني جي جانچ ڪرڻ لاءِ جنهن ۾ RNase سرگرمي جي روڪٿام شامل آهن (جهڙوڪ تيز آئنڪ طاقت جو حل، pH<4 يا pH>9 بفر، پروٽين ڊينيٽرينٽس، وغيره)، ماپ جو نتيجو نمونو حل جي مجموعي اينزيم سرگرمي آهي، نه. enzyme جي انفرادي سرگرمي.
Dilute DNase I معياري (10mg/mL) معياري Dilution Buffer سان ھيٺ ڏنل آھي:
| نه. | تياري جو عمل | توجهه |
| 1 | 2μL RNase A معياري + 198μL معياري Dilution بفر | 0. 1mg/mL |
| 2 | 2μL نمبر 1 نموني + 198μL معياري Dilution بفر | 1×10-3mg/mL |
| 3 | 2μL نمبر 2 نموني + 198μL معياري Dilution بفر | 1×10-5mg/mL |
| 4 | 2μL نمبر 3 نموني + 198μL معياري Dilution بفر | 1×10-7mg/mL |
| 5 | 100μL نمبر 4 نموني + 100μL معياري Dilution بفر | 5×10-8mg/mL |
نمبر 5 نموني کي DNase ۽ RNase فري پاڻي سان 10 ڀيرا گھٽايو:
| 6 | 20μL نمبر 5 نموني + 180μL DNase ۽ RNase-مفت پاڻي | 5×10-9mg/mL، 5 پي جي / ايم ايل |
نمبر 6 نموني هڪ مثبت ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويندو آهي؛DNase ۽ RNase-مفت پاڻي هڪ منفي ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويندو آهي.
4.Dosing ۽ ٽيسٽ
1) شامل ڪريو 10μL آر اين اي پروب ڪم ڪندڙ حل ۽ 10μL 10 × رد عمل حل 96-سٺي پليٽ تي.4 کوهن کي منتخب ڪريو ناڪاري ڪنٽرول ۽ مثبت ڪنٽرول شامل ڪرڻ لاءِ، ۽ ٻيا کوهه شامل ڪرڻ لاءِ نمونا شامل ڪرڻ لاءِ ٽيسٽ ڪيا وڃن.هر نموني لاءِ 2 گهڻا کوهه آهن، هر کوهه لاءِ 80μL؛
2) فوري طور تي 0 منٽ لاءِ فلورسنس سگنل ويليو RFU0 ٽيسٽ ۽ پڙهو.30 منٽ لاءِ 37 ℃ تي اونداھي ۾ رکڻ کان پوءِ، 30 منٽ لاءِ وري فلورسنس سگنل ويليو RFU30 کي ٽيسٽ ۽ پڙھو.جيڪڏهن متحرڪ موڊ اختيار ڪيو ويو آهي، 0 ~ 30 منٽ لاء سڀ فلورسنس سگنل پڙهي سگهجن ٿا.
امتحان جي نتيجن جي تشريح
جيڪڏهن RFU30≥2×RFU0، اهو سمجهيو ويندو آهي ته نمونو آزمائشي RNase پاران آلوده آهي.
نوٽ: جيڪڏهن جانچڻ لاءِ نمونو سنجيده آلود آهي يا ان ۾ مداخلت ڪندڙ مادا شامل آهن، اهو ٿي سگهي ٿو ته RFU0 (آزمائڻ لاءِ نمونو) > RFU0 (مثبت معيار جو ڪنٽرول) ۽ RFU30 (نموڻ جو نمونو) < 2 ×RFU0 (جنهن لاءِ نمونو) آزمائشي)، غلط منفي فيصلي جي ڪري.هن وقت، ٽيسٽ ڪرڻ لاءِ نمونو DNase ۽ RNase-مفت پاڻي سان اڳ ۾ ٺهيل هوندو، ۽ پوءِ جانچيو ويندو.
مقدار جي چڪاس
جڏهن نمونو آزمايو وڃي ته آلوده آهي ۽ اهو ضروري آهي ته نموني ۾ RNase جي ڪنسنٽريشن قدر جو اندازو لڳايو وڃي، اهو هيٺين طريقي سان طئي ڪري سگهجي ٿو:
RNase A معياري (10mg/mL) معياري Dilution Buffer سان ھيٺ ڏنل آھي:
| نه. | تياري جو عمل | ڪنسنٽريشن |
| 1 | 2μL RNase هڪ معياري + 198μL معياري Dilution بفر | 0. 1mg/mL |
| 2 | 2μL نمبر 1 نموني + 198μL معياري Dilution بفر | 1×10-3mg/mL |
| 3 | 2μL نمبر 2 نموني + 198μL معياري Dilution بفر | 1×10-5mg/mL |
| 4 | 2μL نمبر 3 نموني + 198μL معياري Dilution بفر | 1×10-7mg/mL |
| 5 | 100μL No.4 نموني + 100μL معياري Dilution بفر | 5×10-8mg/mL |
| 6 | 100μL No.5 نموني + 100μL معياري Dilution بفر | 2.5×10-8mg/mL |
| 7 | 100μL نمبر 6 نموني + 100μL معياري Dilution بفر | 1.25×10-8mg/mL |
| 8 | 100μL نمبر 7 نموني + 100μL معياري Dilution بفر | 6.25×10-9mg/mL |
| 9 | 100μL نمبر 8 نموني + 100μL معياري Dilution بفر | 3. 125×10-9mg/mL |
ان کان پوء نمبر 6 ~ نمبر 9 نمونن کي 10 ڀيرا DNase ۽ RNase فري پاڻي سان ملايو:
| 10 | 20μLNo6 نموني + 180μL DNase ۽ RNase آزاد پاڻي | 2.5×10-9mg/mL |
| 11 | 20μL نمبر 7 نموني + 180μL DNase ۽ RNase آزاد پاڻي | 1.25×10-9 mg/mL |
| 12 | 20μL نمبر 8 نموني + 180μL DNase ۽ RNase آزاد پاڻي | 6.25×10- 10 mg/mL |
| 13 | 20μL نمبر 9 نموني + 180μL DNase ۽ RNase آزاد پاڻي | 3. 13×10- 10 mg/mL |
نمبر 10 ~ نمبر 13 نمونا معيار طور استعمال ڪيا ويا آهن؛DNase ＆ RNase-آزاد پاڻي 0-concentration نموني طور.
RFU0 ۽ RFU30 حاصل ڪرڻ لاءِ 0-ڪنسنٽريشن جو نمونو، معيار ۽ آلود ٿيل نمونن جي چڪاس جي مرحلن مطابق.
حساب ڪريو ∆RFU = RFU30-RFU0، وٺو ∆RFU (0 ڪنسنٽريشن) ۽ ∆RFU (معياري) کي آرڊينيٽ جي طور تي ۽ RNase ڪنسنٽريشن کي معيار جي طور تي abscissa (0 ڪنسنٽريشن 0 آهي)، لڪير جي فٽٽنگ کي انجام ڏيو، ۽ ڳڻپيو فيٽنگ مساوات y = ax + B، ۽ رابطي جي کوٽائي r هجڻ گهرجي ≥ 0.99.∆RFU (آلود ٿيل نمونو) کي مساوات ۾ y جي طور تي آڻيو، x کي ڳڻيو، ۽ ان کي نم جي اڳ-ڊيليشن ملٽي سان ضرب ڪريو ته جيئن آلوده ٿيل نموني جي لڳ ڀڳ ڪنسنٽريشن قيمت حاصل ڪجي.
نوٽ: اوزار جي سگنل جي وهڪري جي ڪري، اهو ٿي سگهي ٿو ته ∆RFU <0، هن وقت، ان کي ∆RFU = 0 طور شمار ڪيو وڃي ٿو.
تشخيص ڪارڪردگي
1. ڳولڻ جي حد: RNase A: 0.313pg/mL، ~ 1.56×10-9U/μL
2.درستي: انٽرا بيچ ڪوفيشيٽ آف ويريشن ≤ 10٪، انٽر بيچ ڪوفيشيٽ آف ويريشن ≤ 15٪
ڌيان ڏيڻ
1. نموني شامل ڪرڻ واري آپريشن کي جيترو جلدي ممڪن ٿي سگھي.تمام ڊگهو وقت تجربو جي درستگي کي متاثر ڪندو.
2. مختلف فلورسنٽ اينزيم ليبلنگ آلات جا پيرا ميٽر مختلف آهن.پهرين ٽيسٽ کان اڳ مناسب فائدو مقرر ڪريو.
3. استعمال ڪرڻ کان اڳ سڀ reagents پوريء طرح shaken ڪيو وڃي.نموني شامل ڪرڻ وقت، شامل ڪيل نمونن کي اينزيم ليبل پليٽ جي تري ۾ چڱي طرح شامل ڪيو وڃي ته جيئن انھن کي کوھ جي ڀت جي مٿئين حصي ۾ شامل ڪرڻ کان بچڻ.جڏهن نموني شامل ڪريو، ڌيان ڏيو ته ڦوٽو يا بلبل پيدا نه ڪريو.
4. کٽ ۾ معيار RNase A آهي، ۽ ان جي فعال يونٽ جي وضاحت ڪئي وئي آهي اينزيم جو هڪ يونٽ 1.0 جي جذبي ۾ 260 nm تي وڌائي ٿو جڏهن خمير RNA کي 37 ° C ۽ pH 5.0 تي هائيڊولائز ڪيو ويندو آهي [1].پنجاهه يونٽ لڳ ڀڳ 1 Kunitz يونٽ جي برابر آهن[2].
5.خارجي RNase آلودگي کان بچڻ لاء، DNase RNase دور کي تجرباتي ٽيبل جي مٿاڇري، دستانن ۽ ٻين سطحن تي اسپري ڪري سگھجي ٿو.5 منٽن کان پوء، انهن کي صاف ڪاغذن جي ٽوال سان صاف ڪريو ۽ پوء تجرباتي عملن کي انجام ڏيو.
