T7 آر اين اي پوليمريز
T7 RNA Polymerase T7 فيج مان هڪ DNA-انحصار RNA پوليمريز آهي، جيڪو هڪ مضبوط ۽ مخصوص 5´→ 3´ RNA پوليمريز سرگرمي رکي ٿو. T7 RNA پوليمريز T7 پروموٽر سيڪيونس لاءِ اعليٰ خصوصيت رکي ٿو ۽ ڊي اين اي فريگمينٽ مان آر اين اي جي وڏي مقدار کي گڏ ڪري ٿو. هڪ پروموٽر کان هيٺيون وهڪرو داخل ڪيو ويو.
اجزاء
T7 RNA پوليميرس (50 U/μL)
10×HH T7 بفر
اسٽوريج حالتون
0 °C هيٺ ٽرانسپورٽ ۽ اسٽوريج -25 ~ - 15 ° سي.
تفصيل
| شئ جو نالو | T7 آر اين اي پوليمريز |
| پيداوار جي خصوصيت | صاف مائع |
|
سرگرمي يونٽ جي تعريف | ھڪڙي يونٽ کي اينزيم جي مقدار جي طور تي بيان ڪيو ويو آھي جيڪو 1 nmol PPi پيدا ڪرڻ لاءِ NTP کي متحرڪ ڪندو 1 ڪلاڪ 37 ° C تي معياري رد عمل سسٽم تحت. |
| اسٽوريج بفر | 50 mM Tris-HCl، 100 mM NaCl، 20 mM β-M، 1 mM EDTA، 50% گليسرول، 0.1٪ (w/v) Triton® X-100, pH 7.9 @ 25°C. |
|
10×HH T7 بفر | 400 ايم ايم ٽريس-ايڇ سي ايل (25℃، پي ايڇ 8.20)،60 ايم ايم MgCl2، 100 ايم ايم ڊي ٽي ٽي، 20 ايم ايم اسپرميڊين. |
| اسٽوريج جي حالت | -25 ~ - 15℃، بار بار منجمد ٿيڻ کان پاسو ڪريو |
رد عمل ۽ حالت
روايتي ردعمل
| ريجنٽ | رقم |
| نيوڪليس-آزاد H2O يا DEPC-علاج ٿيل پاڻي | 20 μL تائين |
| 10×HH T7 بفر | 2 μL |
| ATP/GTP/CTP/UTP (100 mM هر هڪ) | 0.4 μL هر هڪ (2 ايم ميچ فائنل) |
| RNase Inhibitor (40 U/μL) (اختياري) | 1 μL (40 U) |
| Pyrophosphatase غير نامياتي (اختياري) | 0.5 μL (0.05U) |
| T7 آر اين اي پوليمرس (50 يو / μL) | 1 μL |
| لينر ٿيل ڊي اين اي ٽيمپليٽ | 1 μg |
رد عمل جا جزا شامل ڪريو مٿين ترتيب ۾ * 10 × HH T7 بفر صرف 2mM NTPs لاءِ موزون آهي، ٻيون High Yield T7 ٽرانسپشن ڪٽس 7.5mM- 10mM NTPs لاءِ تجويز ڪيل آهن.
انڪيوبيشن جو وقت:37 ° C 2 ڪلاڪ لاء.
اسٽوp رد عمل جو: 2μL 0.2 M EDTA (pH8.0@25℃) شامل ڪريو يا 10 منٽ لاءِ 75 °C تي گرمي ڪريو.
ڊي اين اي هٽائڻ: DNA ٽيمپليٽ 2U DNase I (RNase-free) سان ختم ڪري سگھجي ٿو ۽ 15 منٽ لاءِ 37 ° تي انڪيوبيشن.
معيار تي ضابطو
•Endonuclease سرگرمي: هڪ 50μL رد عمل جو انڪيوبيشن جنهن ۾ گھٽ ۾ گھٽ 50U T7 RNAPolymerase 1 μg λDNA سان 16 ڪلاڪن تائين 37 ℃ تي نتيجو اهو طئي ڪيو ويو ته ڪنهن به خرابي جو پتو نه پوي.
•Exonuclease سرگرمي: هڪ 50μL رد عمل جو انڪيوبيشن جنهن ۾ گھٽ ۾ گھٽ 50U جو T7 RNA پوليمريز 1 μg λ -Hind Ⅲ DNA کي 16 ڪلاڪن لاءِ 37℃ تي ھضم ڪيو وڃي، نتيجي طور طئي ٿيل ڪنھن به قسم جي خرابي نه ٿي سگھي.
•نڪاس سرگرمي: 1μg pBR322 DNA سان 1μg pBR322 DNA جي گھٽ ۾ گھٽ 50U تي مشتمل 50μL رد عمل جو 37°C تي 16 ڪلاڪن لاءِ 50μL جي رد عمل جو تعين ڪيل طور تي ڪو به پتو نه ٿو پوي.
•RNase سرگرمي: هڪ 50μL رد عمل جو انڪيوبيشن جنهن ۾ گهٽ ۾ گهٽ 50U جو T7 RNA پوليمريز 1.6μg MS2 RNA سان 16 ڪلاڪن تائين 37°C تي 16 ڪلاڪن لاءِ نتيجو اهو طئي ڪيو ويو آهي ته ڪنهن به قسم جي تباهيءَ جو پتو نه پوي.
•گرمي جي غير فعال ٿيڻ: 75 °C 10 منٽ لاء.
احتياط
• ٽرانسڪرپشن جو رد عمل RNase آلودگي کان پاڪ ماحول ۾ ڪيو وڃي.دستانو پائڻ جي صلاح ڏني وئي آهي.ٽوپيون، نلڪيون ۽ پاڻي nuclease آزاد هجڻ گهرجي.
• آر اين اي جي پيداوار جي پيداوار کي بهتر ڪري سگهجي ٿو NTP جي ڪنسنٽريشن (هر ڪنسنٽريشن 10 ايم ايم تائين پهچي سگهي ٿو)، جڏهن ته Mg2+ ڪنسنٽريشن کي مناسب طور تي وڌائڻ جي ضرورت آهي.
• RNA synthesis Reaction mixture ڪمري جي گرمي پد تي تيار ڪيو وڃي، ڇو ته DNA 4°C تي 10×HH T7 بفر جي موجودگيءَ ۾ تيز ٿي سگهي ٿو.
• مناسب ڊگھائي ٽرانسڪرپٽس جي پيداوار گھٽجي ٿي جيڪڏھن ٽيمپليٽ ڊي اين اي نامڪمل طور تي لڪير ٿيل آھي.• رد عمل جو مرکب مٿي يا هيٺ ڪري سگهجي ٿو.• جيڪڏهن رد عمل جي پيداوار جي پيداوار گهٽجي ويندي آهي، 20 ايم ايم تازو ڊي ٽي ٽي رد عمل سسٽم ۾ شامل ڪري سگهجي ٿو.
• نقل ٿيل ٽڪرا 500bp کان گھٽ يا برابر آھن، ۽ اھو سفارش ڪئي وئي آھي ته ٽرانسڪرپشن جي وقت کي 4-8 ڪلاڪ تائين وڌايو وڃي.
10×HH T7 ۾ ڳولهڻ آسان آهن.
