پلانٽ سڌو PCR کٽ
ٻلي نمبر: HCR2020A
ٻوٽي جي سڌي PCR کٽ ٻوٽن جي پنن، ٻج وغيره جي سڌي طرح وڌائڻ لاءِ موزون آهي، ۽ ٻوٽن جي نمونن جي اعليٰ ذريعي چڪاس لاءِ استعمال ٿي سگهي ٿي جن ۾ پولي سيڪرائڊس ۽ پوليفينول شامل نه آهن.سڌي طرح ايمپليفڪيشن ڊي اين اي پوليمريز جي بنياد تي هدايت ڪئي وئي آهي ته ٻوٽن ۾ پي سي آر جي روڪٿام لاء اعلي رواداري آهي.ان کان علاوه، اهو اعلي ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي کي برقرار رکي ٿو، جيڪا 5 kb جي اندر ڊي اين اي جي ٽڪرن کي وڌائڻ لاء مناسب آهي.ڪٽ ۾ موجود منفرد ليسس بفر A کي استعمال ڪري سگھجي ٿو تازو يا منجمد ٻوٽن جي بافتن کي ليس ڪرڻ لاءِ.اهو هلائڻ لاء آسان آهي ۽ lysate صفائي کان سواء amplification لاء هڪ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪري سگهجي ٿو.سسٽم ۾ حفاظتي ايجنٽ شامل آهن جيڪي خام نموني کي بار بار منجمد ڪرڻ ۽ پگھلڻ کان پوء موثر انداز ۾ وڌايو وڃي ٿو.2 × پلانٽ ڊائريڪٽ ماسٽر ميڪس کي صرف پرائمر ۽ ٽيمپليٽس شامل ڪرڻ جي ضرورت آهي ايمپليفڪيشن رد عمل کي انجام ڏيڻ لاءِ، ان سان پائپنگ جي عملن کي گھٽائڻ ۽ نتيجن جي چڪاس جي ذريعي ۽ ٻيهر پيداوار کي بهتر بنائڻ.
اجزاء
| اجزاء | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × پلانٽ سڌو ماسٽر ميڪس | 1.25 مليل | 4 × 1.25 مليل |
| پلانٽ سڌو ليسس بفر اي | 5 مليل | 20 مليل |
| پلانٽ سڌو ليسس بفر بي* | 5 مليل | 20 مليل |
*پلانٽ ڊائريڪٽ لائسس بفر بي هڪ اختياري ريگينٽ آهي، جيڪو پلانٽ ڊائريڪٽ لائسس بفر اي کي بي اثر ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ته جيئن نمونن جي اسٽوريج جي وقت کي ڊگھي ڪري سگهجي.اهو حقيقي صورتحال جي مطابق استعمال ڪري سگهجي ٿو.
اسٽوريج جون حالتون
2 × پلانٽ سڌو ماسٽر مڪس، اسٽور ڪريو -30 ~ -15℃ ۽ بار بار منجمد ٿيڻ ۽ پگھلڻ کان پاسو ڪريو؛پلانٽ سڌو ليسس بفر، اسٽور تي -30 ~ -15℃ يا 2 ~ 8℃.
آزمائشي عمل
نموني پروسيسنگ-ٻوٽي جي پتي
سڌو طريقو:اهو نوجوان پنن کي استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي.ننڍو ۽ يونيفارم نموني حاصل ڪرڻ لاءِ 0.5 - 3 ملي ميٽر جي مقرر قطر سان سوراخ جو پنچ استعمال ڪريو، ۽ پوءِ سڌو سنئون نموني کي PCR سسٽم ۾ شامل ڪريو (50 μl سسٽم سفارش ڪئي وئي آهي).نوٽ، پڪ ڪريو ته نمونو PCR حل ۾ آهي ۽ ٽيوب جي ڀت جي خلاف نه آهي.جيڪڏهن سڌو PCR ڊگھي ٽڪرن ۽ پيچيده نمونن کي وڌائڻ لاءِ استعمال ڪيو وڃي، ته نموني کي ننڍي قطر (0.5 – 1 ملي ميٽر) سان نموني استعمال ڪرڻ سان بهتر نتيجا حاصل ڪرڻ ۾ مدد ملي سگهي ٿي.
پيسڻ جو طريقو:اهو نوجوان پنن کي استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي.پني جو هڪ ننڍڙو ٽڪرو وٺو (قطر ۾ 1 - 3 ملي ميٽر)، ان کي 20 μl ٻوٽي جي سڌي ليسس بفر ايب ۾ رکو، ۽ جيترو ٿي سگهي ان کي پيس ڪريو (اهو قدم 100 μl پائيپٽ ٽپ سان پتي کي نچوض ڪندي ڪري سگهجي ٿو. نموني کي ميش ڪرڻ لاء).جيڪڏهن پتي جي ٽشو جا وڏا حجم استعمال ڪيا وڃن (7 ملي ايم کان وڌيڪ نه هجن)، ڊيليشن بفر جي مقدار کي 50 μl تائين وڌايو.پنن کي زمين کان پوء، حل سائي ظاهر ٿيڻ گهرجي.ٿورڙي centrifugation کان پوء، 1 μl سپرنٽنٽ شامل ڪريو پي سي آر سسٽم کي رد عمل ٽيمپليٽ جي طور تي.
حرارتي lysis جو طريقو:اهو نوجوان پنن کي استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي.پني جو هڪ ننڍڙو ٽڪرو وٺو (قطر ۾ 1 - 3 ملي ميٽر)، ان کي 20 μl ٻوٽي جي سڌي ليسس بفر اي ۾ رکو، ۽ ان کي 95 ° C تي 5 - 10 منٽ لاء گرم ڪريو.lysis جو وقت انهن پنن لاءِ مناسب طور تي وڌائي سگهجي ٿو جن کي لڪائڻ ڏکيو آهي (20 منٽ کان وڌيڪ نه).جيڪڏهن پتي جي ٽشو جا وڏا حجم استعمال ڪيا وڃن (7 ملي ايم کان وڌيڪ نه هجن)، ڊيليشن بفر جي مقدار کي 50 μl تائين وڌايو.گرم ڪرڻ کان پوء، مختصر طور تي سينٽرفيوج ڪريو، ۽ 1 μl سپرنيٽنٽ شامل ڪريو PCR سسٽم کي رد عمل ٽيمپليٽ جي طور تي.
نموني پروسيسنگ- ٻج پوکڻ
پيسڻ جو طريقو:5 ملي ميٽر جي قطر سان ٻج کي ڪٽڻ لاءِ اسڪيلپل استعمال ڪريو، ان کي 100 μl ٻوٽي جي سڌي ليسس بفر اي ۾ شامل ڪريو، ۽ نموني کي پائپٽ جي ٽپ يا ٻين اوزار سان پيس ڪريو.وورٽيڪس مختصر طور تي ۽ ڪمري جي حرارت تي 3 - 5 منٽ لاء بيهڻ ڏيو.پڪ ڪريو ته ٻج جو نمونو ڊيليشن بفر ۾ ٻڏي ويو آهي.هڪ مختصر centrifugation کان پوء، هڪ ردعمل ٽيمپليٽ جي طور تي PCR نظام ۾ supernatant جي 1 μl شامل ڪريو.
حرارتي lysis جو طريقو:5 ملي ميٽر جي قطر سان ٻج کي ڪٽڻ لاءِ اسڪيلپل استعمال ڪريو، انھن کي 100 μl ٻوٽي جي سڌي ليسس بفر اي ۾ شامل ڪريو، ۽ 5 - 10 منٽ لاءِ 95 ° سي تي گرم ڪريو.ليسس جو وقت مناسب طور تي انهن پنن لاءِ وڌائي سگهجي ٿو جن کي لڪائڻ ڏکيو آهي (30 منٽ کان وڌيڪ نه).گرم ڪرڻ کان پوء، مختصر طور تي centrifuge، ۽ 1 μl سپرنيٽنٽ شامل ڪريو PCR سسٽم کي رد عمل ٽيمپليٽ جي طور تي.
هڪScissors يا ٻيا اوزار پڻ استعمال ڪري سگھجن ٿيون مناسب سائيز جا نمونا ڪٽڻ لاء؛جيڪڏهن پنچ يا اسڪيسر ٻيهر استعمال ڪيا وڃن، انهن کي هر استعمال کان اڳ 2٪ سوڊيم هائپو ڪلورائٽ سان صاف ڪيو وڃي ته جيئن نمونن جي وچ ۾ ڪراس آلودگي کي روڪي سگهجي.
ب.پڪ ڪريو ته پلانٽ سڌو ليسس بفر استعمال ڪرڻ کان اڳ مڪمل طور تي ڳري ويو آهي.جيڪڏهن بفر ويسڪس آهي يا تيز آهي، ان کي استعمال ڪرڻ کان اڳ مڪمل طور تي پگھلڻ لاء 37 ℃ تي گرم ڪري سگهجي ٿو.
ج.ردعمل سسٽم ۾ ٽيمپليٽ جي مقدار کي مناسب طور تي ترتيب ڏئي سگهجي ٿو ٻوٽي جي مواد جي مقدار ۾ فرق جي مطابق ۽ شامل ڪيل diluent.
پلانٽ سڌو ليسس بفر
هن پراڊڪٽ ۾ موجود ٻوٽن جي سڌي ليسس بفر A کي سختي سان بهتر ڪيو ويو آهي ته جيئن اڪثر ٻوٽن جي بافتن جي جينوم کي آزاد ڪيو وڃي ۽ 4 ℃ تي خام ٻوٽن جي مختصر مدت جي اسٽوريج لاءِ موزون آهي.جيڪڏهن نموني کي گهڻي عرصي تائين ذخيرو ڪرڻ جي ضرورت آهي (مثال طور، 1 - 2 مهينا)، اها سفارش ڪئي وئي آهي ته سپرنٽنٽ کي نئين EP ٽيوب ڏانهن منتقل ڪيو وڃي ۽ ان کي -20 ℃ تي ذخيرو ڪيو وڃي.نمونن کي وڌيڪ مستحڪم رکڻ لاءِ، منتقل ٿيل سپرنيٽنٽ ۾ پلانٽ ڊائريڪٽ لائسس بفر بي جي برابر مقدار شامل ڪريو، چڱي طرح ملايو ۽ -20 ℃ تي ذخيرو ڪريو.مستحڪم اسٽوريج وقت ٻوٽن جي نموني ۽ رياستن سان مختلف آهي.
رد عمل سسٽم
| ڊي ايڇ2O | 20.0 µl تائين | 50.0 µl تائين |
| 2 × پلانٽ سڌو ماسٽر ميڪسa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| پرائمر 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| پرائمر 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| ٻوٽي جي پتي / خام ڪڍڻ جو نمونو(نموني پروسيسنگ ڏانهن رجوع ڪريو) | 0.5 - 3 ملي ليف ڊسڪ/x µl | 0.5 - 3 ملي ليف ڊسڪ/x µl |
هڪاهو مشتمل آهي Mg2+2 ايم ايم جي آخري ڪنسنٽريشن تي.
ب.اهو هر پرائمر لاء 0.4μM جي آخري ڪنسنٽريشن استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي.پرائمر جو گهڻو استعمال غير مخصوص امپلائيشن کي وڌائيندو.
ج.استعمال ٿيل نموني جو مقدار اصل صورتحال جي مطابق ترتيب ڏئي سگهجي ٿو.خام ليز ٿيل نموني جي هڪ واحد رد عمل ۾ استعمال ڪيل مقدار کي رد عمل جي ڪل مقدار جي 2٪ - 20٪ جي وچ ۾ ترتيب ڏئي سگهجي ٿو.تمام گھڻا نمونا استعمال ڪري سگھي ٿو amplification ناڪامي سبب.
رد عمل پروگرام
| قدم | گرمي پد | وقت |
| شروعاتي ڊينيچريشن | 98 ℃ | 5 منٽ |
| رد ڪرڻ | 95 ℃ | 10 سيڪنڊ |
| اينيلنگ | 58 ~ 72 ℃ | 15 سيڪنڊ |
| واڌارو | 72 ℃ | 30 سيڪنڊ |
| فائنل توسيع | 72 ℃ | 5 منٽ |
هڪشروعاتي ڊينيچريشن (98℃، 5 منٽ) ٻوٽن جي ٽشوز جي ليسس کي فروغ ڏئي ٿو، جينومڪ ڊي اين اي کي جاري ڪري ٿو جيڪو پي سي آر ايمپليفڪيشن لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو.وقت گھٽ نه ڪريو يا گرمي پد کي گھٽايو.
ب.ان کي پرائمر Tm قدر جي برابر يا 2 ~ 4℃ Tm قدر کان وڌيڪ مقرر ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي.هن پراڊڪٽ ۾ استعمال ٿيندڙ سڌي ايمپليفڪيشن ڊي اين اي پوليمريز روايتي تاڪ ڊي اين اي پوليمريز کان مختلف آهي، ۽ ان کي رد عمل اينيلنگ جي درجه حرارت لاءِ خاص گهرجون آهن؛ اعلي اينيلنگ جي درجه حرارت جو استعمال مؤثر طور تي غير مخصوص ايمپليفڪيشن کي گهٽائي سگهي ٿو ۽ امپليفڪيشن جي ڪارڪردگي کي بهتر بڻائي ٿو.پيچيده ٽيمپليٽس لاء، موثر واڌارو حاصل ڪري سگهجي ٿو annealing جي درجه حرارت کي ترتيب ڏيڻ ۽ وڌائڻ واري وقت کي وڌايو.
ج.جيڪڏهن ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ جي ڊيگهه ≤1 kb آهي، واڌ جو وقت مقرر ڪيو ويو آهي 30 سيڪنڊ/kb؛جيڪڏهن ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ جي ڊيگهه > 1 kb آهي، واڌ جو وقت مقرر ڪيو ويو آهي 60 سيڪنڊ/kb.
ڊي.پيچيده نمونن يا نمونن لاءِ گھٽ وڌائڻ واري پيداوار سان، سائيڪلن جو تعداد مناسب طور تي 40 -50 سائيڪلن تائين وڌائي سگھجي ٿو.
درخواستون
اهو ٻوٽن جي بافتن جي سڌي طرح وڌائڻ ۽ ٻوٽن جي نمونن جي اعلي سطحي اسڪريننگ لاءِ لاڳو ٿئي ٿو جنهن ۾ پولي سيڪرائڊس ۽ پوليفينول شامل نه آهن.
نوٽس
صرف تحقيق لاء استعمال ڪريو.تشخيصي طريقيڪار ۾ استعمال لاء نه.
1. ڪروڊ پلانٽ ايمپليفڪيشن يا سڌي طرح ايمپليفڪيشن لاءِ، تجربي کي شروع ڪرڻ کان اڳ صاف ٿيل جينومڪ ڊي اين اي کي مثبت ڪنٽرول طور استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي ته جيئن سسٽم، پرائمر ۽ آپريشن درست آهن.
2. هن کٽ ۾ استعمال ٿيل سڌي ايمپليفڪيشن ڊي اين اي پوليميرس مضبوط پروف ريڊنگ سرگرمي آهي.جيڪڏهن TA ڪلوننگ کي انجام ڏيڻ جي ضرورت آهي، اها سفارش ڪئي وئي آهي ته ايڊينائن شامل ڪرڻ کان پهريان ڊي اين اي کي صاف ڪيو وڃي.
3. پرائمر ڊيزائن ھدايت:
هڪاها صلاح ڏني وئي آهي ته پرائمر جي 3′ آخر ۾ آخري بنياد G يا C هجڻ گهرجي.
ب.پرائمر جي 3′ آخر ۾ آخري 8 بيسز ۾ لڳاتار بي ميلن کان پاسو ڪيو وڃي.ج.پرائمر جي 3′ پڇاڙيءَ تي وار پنن جي جوڙجڪ کان پاسو ڪريو.
ڊي.فارورڊ پرائمر ۽ ريورس پرائمر جي Tm قدر ۾ فرق 1℃ کان وڌيڪ نه ھئڻ گھرجي ۽ Tm ويليو کي 60 ~ 72℃ تي ايڊجسٽ ڪيو وڃي.
e.اضافي اضافي پرائمر ترتيبون جيڪي ٽيمپليٽ سان نه ملن ٿيون، شامل نه ٿيڻ گهرجن جڏهن پرائمر Tm قدر جي حساب سان.
f.اهو سفارش آهي ته پرائمر جي GC مواد 40٪ -60٪ هجڻ گهرجي.
جي.پرائمر ۾ A، G، C ۽ T جي مجموعي ورهاست جيترو ٿي سگهي هجڻ گهرجي.اعلي GC يا AT مواد سان علائقن کي استعمال ڪرڻ کان پاسو ڪريو.
ايڇ.پرائمر جي اندر يا ٻن پرائمر جي وچ ۾ 5 يا وڌيڪ بيسز جي ڪمپليمينٽري تسلسلن جي موجودگي کان پاسو ڪريو ۽ ٻن پرائمر جي 3′ آخر ۾ 3 يا وڌيڪ بيسز جي ڪمپليمينٽري تسلسل جي موجودگي کان پاسو ڪريو.
i.NCBI BLAST فنڪشن استعمال ڪريو پرائمر جي خاصيت کي جانچڻ لاءِ غير مخصوص امپليڪشن کي روڪڻ لاءِ.
