mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´-O-methyltransferase هڪ ريزومبيننٽ E. coli strain مان نڪتل آهي جيڪو ويڪسينيا mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase لاءِ جين کڻي ٿو.هي اينزائيم RNA جي 5′ آخر ۾ ڪيپ جي ڍانچي جي ڀرسان پهرين نيوڪليوٽائيڊ جي 2´-O پوزيشن تي ميٿائل گروپ جو اضافو ڪري ٿو. هي اينزائيم S-adenosylmethionine (SAM) کي ميٿائل ڊونر طور استعمال ڪري ٿو ميٿيل ڪيپ ٿيل RNA (ڪيپ) -0) نتيجي ۾ ڪيپ 1 جي جوڙجڪ.

Cap1 ڍانچي ترجمي جي ڪارڪردگي کي وڌائي سگھي ٿو، منتقلي ۽ microinjection تجربن ۾ mRNA جي اظهار کي بهتر بڻائي ٿو. ھن اينزيم کي خاص طور تي RNA جي ضرورت آھي ھڪڙي m7GpppN ڪيپ جي طور تي.اهو 5´ جي آخر ۾ pN، ppN، pppN يا GpppN سان RNA استعمال نٿو ڪري سگهي.ڪيپ ٿيل آر اين اي تيار ٿي سگھي ٿي ان ويٽرو ٽرانسڪرپشن ذريعي ڪيپ اينالاگ استعمال ڪندي يا ويڪسينيا ڪيپنگ اينزائم استعمال ڪندي اينزيميٽڪ ڪيپنگ ذريعي.

اجزاء

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10 × ڪيپنگ رد عمل بفر

ذخيرو

اسٽوريج لاءِ -25 ～- 15℃

اسٽوريج بفر

20 mM Tris-HCl (pH 8.0，25℃)، 100 mM NaCl، 1 mM DTT، 0. 1 mM EDTA، 0. 1% Triton X- 100، 50% گليسرول.

يونٽ جي تعريف

ون يونٽ جي وضاحت ڪئي وئي آهي اينزيم جي مقدار کي ميٿيليٽ ڪرڻ لاءِ گهربل 80 nt ڪيپ ٿيل RNA ٽرانسڪرپٽ جي 10 pmoles کي 1 ڪلاڪ ۾ 37 ° C تي.

معيار تي ضابطو آڻڻ جا امتحان

Exonuclease:50U جو mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1μg λ-Hind III سان گڏ DNA 37 ℃ تي 16 ڪلاڪن تائين ڊائجسٽ ٿئي ٿو ڪو به تباهي پيدا نٿو ٿئي جيئن ايگرز جيل الیکٹروفورسس پاران طئي ڪيو ويو آهي.

Endonuclease: 50 U جو mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1 μg λDNA سان 37℃ تي 16 ڪلاڪن لاءِ ڪا به خرابي پيدا نه ٿيندي جيئن ايگرز جيل اليڪٽرروفورسس پاران طئي ٿيل آهي.

نڪاس: 50U جو mRNA ڪيپ 2 ´ -O-Methyltransferase 1μg pBR322 سان 37 ℃ تي 16 ڪلاڪن لاءِ ڪا به خرابي پيدا نه ڪندو آهي جيئن ايگرز جيل اليڪٽرروفورسس پاران طئي ٿيل آهي.

RNase: 50U جو mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1.6μg MS2 RNA سان 4 ڪلاڪن لاءِ 37℃ تي ڪا به خرابي پيدا نه ٿيندي جيئن ايگرز جيل اليڪٽرروفورسس پاران طئي ٿيل آهي.

E. ڪولي ڊي اين اي: 50U جو mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase جي موجودگي لاءِ اسڪريننگ ڪئي وئي آهي.E. ڪولي جينومڪ ڊي اين اي استعمال ڪندي TaqMan qPCR لاءِ مخصوص پرائمر سانE. ڪولي 16S rRNA لوڪس.جيE. ڪولي جينومڪ ڊي اين اي آلودگي = 1 آهيE. ڪولي جينوم.

بيڪٽيريا Endotoxin: LAL-ٽيسٽ، چيني فارماڪوپيا IV 2020 ايڊيشن جي مطابق، جيل جي حد ٽيسٽ جو طريقو، عام اصول (1143).بيڪٽيريل اينڊوٽوڪسين مواد هجڻ گهرجي = 10 EU/mg.

رد عمل جو نظام ۽ حالتون

1. هڪ 1.5 mL مائڪروفيوج ٽيوب ۾ ڪيپ ٿيل RNA ۽ RNase-free H2O جي مناسب مقدار کي 16.0 µL جي آخري مقدار ۾ گڏ ڪريو.

2. 5 منٽن لاءِ 65 ℃ تي گرم ڪريو ۽ پوءِ 5 منٽن لاءِ آئس باٿ ڪريو.

3. ڏنل آرڊر ۾ ھيٺيون جزا شامل ڪريو (ڪيپ ٿيل آر اين اي جي ميٿيليشن لاءِ

10 کان گهٽ

*10× ڪيپنگ ري ايڪشن بفر: 500 ايم ايم ٽريس-ايڇ سي ايل (پي ايڇ 8.0، 25℃)، 50 ايم ايم ڪي سي ايل، 10 ايم ايم ايم سي ايل2، 10 ايم ايم ڊي ٽي ٽي.

4. 1 ڪلاڪ لاءِ 37℃ تي انڪيوبيشن ڪريو (200 nt کان گھٽ ھدف واري ٽڪري لاءِ 2 ڪلاڪ انڪيوبيشن جي سفارش ڪئي وئي آھي).

درخواستون

microinjection ۽ transfection تجربن دوران mRNA اظهار کي بهتر ڪرڻ لاء.

استعمال تي نوٽس

1. رد عمل کان اڳ، آر اين اي کي صاف ڪيو وڃي ۽ نيوڪليز کان خالي پاڻي ۾ ڦهلايو وڃي، سڀني محلولن ۾ ڪا به EDTA ۽ آئنز نه هجڻ گهرجي.

2. سفارش ڪئي وئي آهي ته نموني آر اين اي کي 65 سينٽي گريڊ تي 5 منٽ اڳ گرم ڪيو وڃي ته جيئن ٽرانسڪرپٽ جي 5´ آخر ۾ ثانوي ڍانچي کي هٽايو وڃي.پيچيده 5 ´ ٽرمينل ڍانچي لاءِ ان کي 10 منٽ تائين وڌائي سگھجي ٿو.