ڊبل اسٽرينڊ RNA (dsRNA) ELISA KIT

هي ڪٽ هڪ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) coupling biotin-Streptavidin سسٽم سان آهي، dsRNA جي مقداري ماپ لاءِ جنهن جي ڊيگهه 60 بيس جوئر (bp) کان مٿي آهي، ترتيب جي لحاظ کان.پليٽ کي اينٽي dsRNA اينٽي باڊي سان اڳي ڪوٽي ڪيو ويو آهي.نموني ۾ موجود dsRNA شامل ڪيو ويو آهي ۽ کوهن تي ليپ ٿيل اينٽي باڊيز سان جڙيل آهي.۽ پوءِ بايوٽينيليٽڊ اينٽي dsRNA اينٽي باڊي شامل ڪئي وئي آهي ۽ نموني ۾ dsRNA سان جڙيل آهي.ڌوئڻ کان پوء، HRP-Streptavidin شامل ڪيو ويو آهي ۽ بايوٽينيليٽ اينٽي ڊي ايس آر اين اي اينٽي باڊي سان ڳنڍيل آهي.انڪيوبيشن کان پوءِ بيحد HRP-Streptavidin ڌوئي وڃي ٿو.پوءِ TMB سبسٽرٽ حل شامل ڪيو ويندو آهي ۽ HRP پاران هڪ نيري رنگ جي پيداوار پيدا ڪرڻ لاءِ شامل ڪيو ويندو آهي جيڪو تيزابي اسٽاپ حل شامل ڪرڻ کان پوءِ پيلي ۾ تبديل ٿي ويندو آهي.زرد جي کثافت پليٽ ۾ قبضو ڪيل dsRNA جي حدف ٿيل مقدار جي متناسب آهي.جذب 450 nm تي ماپي ويندي آهي.

درخواست

هي ڪٽ باقي dsRNA جي مقدار جي ماپ لاءِ آهي.

کٽ جا اجزاء

اسٽوريج ۽ استحڪام

1. اڻ استعمال ٿيل کٽ لاءِ: سڄي کٽ کي محفوظ ڪري سگھجي ٿو 2 ~ 8 ℃ شيلف لائف ۾.اسٽوريج جي استحڪام لاء مضبوط روشني کان بچڻ گهرجي.

2. استعمال ٿيل ڪٽ لاءِ: هڪ ڀيرو مائڪرو پليٽ کوليو وڃي، مهرباني ڪري غير استعمال ٿيل کوهن کي پليٽ سيلر سان ڍڪيو ۽ ورق جي پائوچ تي واپس اچو جنهن ۾ ڊيسيڪنٽ پيڪ شامل آهي، ورق جي پائوچ کي زپ-سيل ڪريو ۽ استعمال کان پوءِ جيترو جلدي ٿي سگهي 2~8℃ تي واپس وڃو.ٻين reagents کي واپس ڪيو وڃي 2 ~ 8 ℃ جيترو جلدي ممڪن ٿي سگهي استعمال کان پوء.

مواد گهربل پر فراهم نه ڪيو ويو

1. 450±10nm فلٽر سان گڏ مائڪروپليٽ ريڊر (بهتر جيڪڏهن 450 ۽ 650 nm موج جي ڊيگهه تي ڳولي سگهجي ٿو).

2. Microplate shaker.

3. RNase-آزاد ٽوٽڪا ۽ centrifuge ٽيوب.

آپريشن فلو چارٽ

توھان کان اڳ شروع ڪريو

1. استعمال ڪرڻ کان اڳ کٽ جا سڀئي حصا ۽ نمونا ڪمري جي حرارت (18-25 ℃) تي آڻيو.جيڪڏهن کٽ هڪ ئي وقت ۾ استعمال نه ٿيندي، ته مهرباني ڪري موجوده تجربي لاءِ صرف اسٽريپس ۽ ريجينٽس ڪڍو، ۽ باقي پٽين ۽ ريجنٽس کي گهربل حالت ۾ ڇڏي ڏيو.

2. واش بفر: 40mL 20x concentrated wash buffer کي 760mL deionized يا distilled water سان 800mL 1× واش بفر تيار ڪرڻ لاءِ.

3. معياري: مختصر طور تي استعمال ڪرڻ کان اڳ اسٽاڪ حل کي اسپن يا سينٽرفيوج ڪريو.مهيا ڪيل چار معيارن جو تسلسل 5ng / μL آهي.UTP ۽ pUTP dsRNA معيارن لاءِ، مھرباني ڪري اسٽاڪ حل کي 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL تي STE بفر سان گھٽ ڪريو معياري وکر ٺاھيو.N1-Me-pUTP dsRNA معيارن لاءِ، مھرباني ڪري اسٽاڪ حل کي 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312، 0pg/μL کي STE بفر سان گھٽ ڪريو معياري وکر ٺاھيو.5-OMe-UTP dsRNA معيار لاءِ، مھرباني ڪري اسٽاڪ حل کي 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL تي STE بفر سان گھٽ ڪريو معياري وکر ٺاھيو.اسان سفارش ڪريون ٿا ته معيار کي هيٺ ڏنل چارٽ طور ملائي سگهجي ٿو:

4. Biotinylated detection antibody and HRP-streptavidin ڪم ڪندڙ حل: مختصر طور تي استعمال ڪرڻ کان اڳ اسٽاڪ حل کي گھمايو يا سينٽرفيوج ڪريو.انهن کي ڪم ڪندڙ ڪنسنٽريشن تي ڊيليشن بفر سان ملايو.

5. TMB سبسٽٽ: محلول جي گهربل مقدار کي جراثيمن واري ٽوڪن سان گڏ ڪريو ۽ باقي بچيل محلول کي ٻيهر شيشي ۾ نه اڇلايو.TMB substate روشنيءَ لاءِ حساس آهي، TMB substrate کي گهڻي وقت تائين روشنيءَ ۾ نه ڏيکاريو.

پروٽوڪول استعمال ڪندي

1. امتحان لاءِ گھربل پٽين جو تعداد طئي ڪريو.استعمال لاء فريم ۾ پٽي داخل ڪريو.باقي پليٽ جون پٽيون جيڪي ھن امتحان ۾ استعمال نه ٿيون آھن تن کي بيگ ۾ desiccant سان ٻيهر پيڪ ڪيو وڃي.ريفريجريٽ ٿيل اسٽوريج لاء بيگ کي مضبوط طور تي بند ڪريو.

2. 100μL هر هڪ معياري، خالي ۽ نمونن کي مناسب کوهن ۾ شامل ڪريو.پليٽ سيلر سان ڍڪيو.1 ڪلاڪ لاء ڪمري جي حرارت تي 500rpm تي ڇڪڻ سان گڏ ڪريو.نمونن کي STE بفر سان ٺهڪندڙ ڪيو وڃي ته جيئن صحيح چڪاس لاءِ مناسب ڪنسنٽريشن.

3. ڌوئڻ جو مرحلو: حل کي اسپيريٽ ڪريو ۽ 250μL واش بفر سان هر کوهه کي ڌويو ۽ ان کي 30s تائين بيهڻ ڏيو.ڌوئڻ واري بفر کي مڪمل طور تي ختم ڪريو پليٽ کي جاذب پيپر تي ڇڪڻ سان.مڪمل طور تي 4 ڀيرا ڌوء.

4. هر کوهه ۾ 100μL بايوٽينيليٽ ڊيٽڪشن اينٽي باڊي ڪم ڪندڙ حل شامل ڪريو.پليٽ سيلر سان ڍڪيو.1 ڪلاڪ لاء ڪمري جي حرارت تي 500rpm تي ڇڪڻ سان گڏ ڪريو.

5. ورجائي واش قدم.

6. هر کوهه ۾ HRP-streptavidin ڪم ڪندڙ حل جو 100μL شامل ڪريو.پليٽ سيلر سان ڍڪيو.30 منٽ لاء ڪمري جي حرارت تي 500rpm تي ڇڪڻ سان.

7. ڌوٻي جي قدم کي ٻيهر ورجايو.

8. هر کوهه ۾ 100μL TMB سبسٽرٽ حل شامل ڪريو.پليٽ سيلر سان ڍڪيو.RT تي 30 منٽ لاء روشني کان بچاء.سبسٽرٽ حل جي اضافي سان مائع نيري ٿي ويندو.

9. هر کوهه ۾ 50μL اسٽاپ حل شامل ڪريو.اسٽاپ حل جي اضافي سان مائع پيلو ٿي ويندو.پوءِ مائڪروپليٽ ريڊر کي ھلايو ۽ فوري طور تي 450nm تي ماپ ڪريو.

نتيجن جو حساب

1. هر معيار، ڪنٽرول، ۽ نمونن لاءِ نقل پڙهڻ جي اوسط ۽ سراسري صفر معياري آپٽيڪل کثافت کي گھٽايو.عمودي (Y) محور تي جذب سان معياري وکر ٺاھيو ۽ افقي (X) محور تي dsRNA ڪنسنٽريشن.

2. اها سفارش ڪئي وئي آهي ته حساب ڪتاب کي ڪمپيوٽر تي ٻڌل وکر-فٽيٽنگ سافٽ ويئر سان انجام ڏيو جهڙوڪ وکر ماهر 1.3 يا ELISA Calc 5 يا 4 پيٽرولر نان لينر فٽ ماڊل ۾.

ڪارڪردگي

1. حساسيت:

معلوم ڪرڻ جي هيٺين حد: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA لاءِ)، ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA لاءِ).

مقدار جي گھٽ حد: 0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA لاءِ)، 0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA لاءِ)، 0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA لاءِ).

2. درستي: انٽرا اسسي جو CV ≤10%، انٽر-Asay جو CV ≤10%

3. وصولي: 80% ~ 120%

4. لڪيريت: 0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA)، 0.0625-1pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA لاءِ).

ويچار

1. TMB رد عمل جي درجه حرارت ۽ وقت نازڪ آهي، مهرباني ڪري انهن کي سختي سان هدايتون مطابق ڪنٽرول ڪريو.

2. سٺي نموني جي پيداوار ۽ حساسيت حاصل ڪرڻ لاءِ، پليٽن جي صحيح ڌوئڻ ضروري آهي ته جيئن اضافي غير رد عمل ٿيل ريجينٽس کي هٽايو وڃي.

3. استعمال ڪرڻ کان اڳ سڀني ريجينٽس کي چڱيءَ طرح ملايو وڃي ۽ نموني يا ريجينٽس جي اضافي دوران bumbles کان پاسو ڪيو وڃي.

4. جيڪڏهن ڪرسٽل ٺهيل واش بفر (20x) ۾ ٺھيل آھن، 37 ℃ تائين گرم ڪريو ۽ ھلڪو ھلايو جيستائين ڪرسٽل مڪمل طور تي گھلجي وڃن.

5. سوڊيم ايزائيڊ (NaN3) تي مشتمل نمونن جي امتحان کان پاسو ڪريو، ڇاڪاڻ ته اهو HRP سرگرمي کي تباهه ڪري سگهي ٿو جنهن جي نتيجي ۾ dsRNA جي مقدار جو اندازو لڳايو ويو آهي.

6. امتحان دوران RNase آلودگي کان بچاء.

7. معياري/نمونءَ، پتو لڳائڻ اينٽي باڊي ۽ SA-HRP به RT تي بغير ڇڪڻ جي ڪري سگهجي ٿو، پر اهو ٿي سگهي ٿو سڃاڻڻ جي حساسيت کي هڪ گنا گهٽائي.ان صورت ۾، اسان سفارش ڪريون ٿا UTP ۽ pUTP dsRNA معيار کي 2pg/μL کان گھٽايو وڃي، N1-Me-pUTP dsRNA معيار کي 4pg/μL کان گھٽايو وڃي ۽ 5-OMe-UTP dsRNA معيار کي 8pg/μL کان گھٽايو وڃي.ان کان علاوه، HRP-streptavidin ڪم ڪندڙ حل کي 60 منٽ لاء ڪمري جي حرارت تي لڳايو.فلاسڪ شيڪر استعمال نه ڪريو، ڇاڪاڻ ته فلاسڪ شيڪر غلط نتيجو ٿي سگهي ٿو.

عام نتيجو

1. معياري وکر ڊيٽا

2. معياري وکر جي حساب سان

3. لائنر ڳولڻ جي حد: 0.0312- 1pg/μL