DNA Extraction Mini Kit
هي ڪٽ آپٽمائزڊ بفر سسٽم ۽ سليڪا جيل ڪالمن پيوريفڪيشن ٽيڪنالاجي کي اختيار ڪري ٿو، جيڪا 70 bp - 20 kb DNA ٽڪڙن کي TAE يا TBE agarose gel جي مختلف ڪنسنٽريشن مان بحال ڪري سگهي ٿي.ڊي اين اي جذب ڪرڻ وارو ڪالم خاص طور تي ڊي اين اي کي وڌيڪ لوڻ واري حالت ۾ جذب ڪري سگھي ٿو.ان کان علاوه، کٽ سڌو سنئون پي سي آر جي شين، اينزيميٽڪ ردعمل سسٽم يا ٻين طريقن سان حاصل ڪيل خام ڊي اين اي پروڊڪٽس مان ڊي اين اي ٽڪڙن کي صاف ڪري سگهي ٿو، ۽ نجاست کي هٽائي سگھي ٿو جهڙوڪ پروٽين، ٻيا نامياتي مرکبات، غير نامياتي لوڻ آئنز ۽ اوليگوني ڪليوٽائڊ پرائمر.اهو يقيني بڻائي سگهجي ٿو ته صفائي 10-15min اندر مڪمل ٿي سگهي ٿي.صاف ٿيل ڊي اين اي سڌو سنئون استعمال ڪري سگهجي ٿو لئگيشن، ٽرانسفارميشن، اينزيم هضم، ويٽرو ٽرانسپشن ۾، پي سي آر، تسلسل، مائڪرو انجيڪشن، وغيره.
اسٽوريج حالتون
-15 ~ -25 ℃ تي اسٽور ۽ ڪمري جي حرارت تي ٽرانسپورٽ.
اجزاء
| اجزاء | (100 rxns) |
| GDP بفر | 80 ملي |
| بفر GW | 2 × 20 مليل |
| Elution بفر | 20 مليل |
| فاسٽ پيور ڊي اين اي ميني ڪالمن-جي | 100 |
GDP بفر:ڊي اين اي پابند بفر.
بفر GW:ڌوئڻ بفر؛استعمال ڪرڻ کان اڳ بوتل تي ظاهر ڪيل حجم سان مطلق ايٿانول شامل ڪريو.
Elution بفر:ايليوشن.
فاسٽ پيور ڊي اين اي ميني ڪالمن-جي:ڊي اين اي جذب ڪندڙ ڪالمن.
جمع ٽيوب 2 ml:فلٽريٽ لاء ٽيوب گڏ ڪرڻ.
تيار ڪيل مواد
1.5 ml sterilized tubes، absolute ethanol ۽ isopropanol (جڏهن DNA ٽڪرا ≤100 bp، 1 حجم شامل ڪريو
isopropanol کان 1 حجم جيل)، پاڻي غسل.
آزمائشي عمل
Buffer GW کي گھٽائڻ لاءِ 80 ml ethanol شامل ڪريو جيئن استعمال ڪرڻ کان اڳ ٽيگ تي اشارو ڪيو ويو آھي، ڪمري جي حرارت تي ذخيرو ڪريو.
ميڪانيزم
1. PCR ردعمل حل
جيل ڪڍڻ وارو منصوبو: برابر حجم بفر شامل ڪريو GDP PCR ردعمل حل بحالي اسڪيم:5 ڀيرا حجم بفر شامل ڪريو
2. جي ڊي پي جيل جي مقدار کي ڳڻيو (100 μايل برابر 100 ملي گرام)
جيل کي ٽوڙيو
3. 50 ~ 55 تي گرم ڪريو℃
4. بانڊ ڌوئڻ
شامل ڪريو 300 μL بفر جي ڊي پي *
700 μL بفر GW شامل ڪريو
700 μL بفر GW شامل ڪريو
5. ايلٽ
20 - 30μL ايليوشن بفر يا ڊيونائيزڊ پاڻي شامل ڪريو
نوٽ* هن قدم کان سواءِ پي سي آر ردعمل سيال وصولي
جيل ڪڍڻ جو پروگرام
1. ڊي اين اي ٽڪڙن کي الڳ ڪرڻ لاءِ ڊي اين اي اليڪٽرروفورسس کان پوءِ، ڊي اين اي فريگمينٽ جي واحد پٽي کي ايگرز جيل مان UV لائيٽ جي هيٺان ڪڍيو.جيل جي ظاهري نمي کي جذب ڪرڻ لاءِ جاذب پيپر استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي ۽ جيل جي سلائس جي سائيز کي گھٽ ڪرڻ لاءِ جيترو ٿي سگهي اضافي اگروز کي هٽائي ڇڏيو.جيل سلائس جو وزن ڪريو (بغير microcentrifuge ٽيوب جي) ان جي مقدار کي ڳڻڻ لاءِ: 100 mg جيل سلائس جو حجم لڳ ڀڳ 100 μL آهي، فرض ڪيو ته کثافت 1g/ml آهي.
2. برابر حجم بفر جي ڊي پي شامل ڪريو، 7-10 منٽ لاءِ 50 ~ 55 ℃ تي انڪيوبيٽ ڪريو (جيل جي سائيز جي مطابق، انڪيوبيشن جي وقت کي ترتيب ڏيو جيستائين جيل مڪمل طور تي ڦهلجي وڃي).انڪيوبيشن دوران ٽيوب کي 2 ڀيرا ڦيرايو.
Δ بفر جي ڊي پي جي 1-3 جلدن جو اضافو ڊي اين جي بحالي جي ڪارڪردگي تي اثر انداز نه ڪندو.جيڪڏهن ڊي اين اي جو ٽڪرو حاصل ڪيو وڃي <100 bp، بفر جي ڊي پي جي 3 حجم شامل ڪرڻ جي ضرورت آهي؛جڏهن جيل سلائس مڪمل طور تي ڦهليل آهي، آئوسوپروپنول جو 1 حجم شامل ڪريو ۽ چڱي طرح ملائي، پوء ايندڙ قدم تي جاري رکو.
3. نموني کي ٽيوب جي تري ۾ آڻڻ لاءِ مختصر طور سينٽرفيوج ڪريو، FastPure DNA Mini Columns-G کي ڪليڪشن ٽيوب ۾ داخل ڪريو 2 ml، احتياط سان منتقل ڪريو وڌ ۾ وڌ 700 μL هڪ ڀيرو.
فلٽريشن ڪالمن تائين وقت، 30-60 سيڪنڊن لاءِ 12,000 rpm (13,800 X g) تي سينٽرفيوج.
4. فلٽريٽ کي رد ڪريو ۽ ڪالمن ۾ 300 μL بفر جي ڊي پي شامل ڪريو، ڪمري جي گرمي پد تي 1 منٽ، سينٽرفيوج کي 12,000 rpm (13,800 X g) تي 30-60 سيڪنڊن لاءِ.
5. فلٽريٽ کي رد ڪريو ۽ 700 μL بفر GW شامل ڪريو (چڪ ڪريو ته ڇا اڳ ۾ مڪمل ايٿانول شامل ڪيو ويو آھي!)، 30-60 سيڪنڊن لاءِ 12,000 rpm (13,800 X g) تي سينٽرفيوج ڪريو.
Δ مھرباني ڪري بفر GW شامل ڪريو adsorption ڪالمن جي ڀت جي چوڌاري، يا Buffer GW پٺتي ڍڪ شامل ڪريو ۽ ان کي 2 - 3 ڀيرا مٿي ھيٺ ڪريو ته جيئن ٽيوب جي ڀت تي لڳل لوڻ کي مڪمل طور تي فلش ڪرڻ ۾ مدد ملي.
6. ورجايو قدم 5.
Δ Buffer GW سان ٻه ڀيرا ڀڄڻ کي يقيني بڻائي سگهجي ٿو ته لوڻ مڪمل طور تي هٽايو ويو آهي ۽ ايندڙ تجربن تي اثر کي ختم ڪري ٿو.
7. فلٽريٽ کي رد ڪريو ۽ خالي ڪالمن کي سينٽرفيوج ڪريو 12,000 rpm (13,800 X g) تي 2 منٽ لاءِ.
8. ڪالمن کي صاف 1.5 ml microcentrifuge ٽيوب ۾ داخل ڪريو، ڪالمن جي جھلي جي مرڪز ۾ 20 - 30 μL ايليوشن بفر شامل ڪريو، 2 منٽ لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو، ۽ پوءِ 12,000 rpm (13,800 X g) تي 12 منٽ لاءِ سينٽرفيوج ڪريو.ڪالمن کي رد ڪريو، حاصل ڪيل ڊي اين اي -20 تي ذخيرو ڪريو.
Δ مرحلا 8 جي سپرنيٽنٽ کي ڪالمن ۾ منتقل ڪرڻ لاءِ ٻيهر ايليوشن ڪرڻ ۽ ايليوشن بفر کي 55 تائين اڳي گرم ڪرڻ (جڏهن ڊي اين اي فريگمينٽ > 3 kb) ٿي سگهي ٿو بحالي جي ڪارڪردگي کي وڌائڻ لاءِ مددگار.
PCR مصنوعات جي وصولي پروگرام
هي پروٽوڪول لاڳو ٿئي ٿو ڊي اين اي جي ٽڪڙن کي پي سي آر جي شين، اينزيميٽڪ ريڪشن سسٽم ۽ ٻين ڊي اين اي خام مصنوعات (جنهن ۾ جينياتي ڊي اين اي سميت).اهو حل مختلف نيوڪليوٽائيڊس، پرائمر، پرائمر ڊيمرز، لوڻ جي ماليڪيولز، اينزائمز ۽ ٻين نجاست کي موثر طريقي سان ختم ڪري سگهي ٿو.
1. مختصر طور تي centrifuge PCR مصنوعات، enzymatic رد عمل حل، ۽ ٻين DNA خام مصنوعات.ان جي مقدار کي پائيپٽ سان اندازو لڳايو ۽ هڪ sterilized 1.5 ml يا 2 ml ٽيوب ڏانهن منتقل ڪريو.ddH2O شامل ڪريو جيستائين حجم 100 μL تائين؛جڏهن ته جينومڪ ڊي اين اي لاءِ اعلي ڪنسنٽريشن سان، ddH2O سان 300 μL تائين گھٽائڻ سان بحالي جي ڪارڪردگي کي بهتر بنائڻ ۾ مدد ملندي.
2. بفر جي ڊي پي جي 5 حجم شامل ڪريو، چڱيء طرح ملايو يا ڦيرائڻ سان.جيڪڏهن دلچسپي جو ڊي اين اي ٽڪرو> 100 bp، اضافي 1.5 حجم (نمونون + بفر GDP) ايٿانول شامل ڪرڻ جي ضرورت آهي.
3. ڪالم کي واپس ڪليڪشن ٽيوب ۾ داخل ڪريو، ملاوٽ کي ڪالمن ۾ منتقل ڪريو، 30 – 60 سيڪنڊن لاءِ 12,000 rpm (13,800 ×g) تي سينٽرفيوج ڪريو.جيڪڏهن مخلوط حل جو مقدار >700 µL آهي، جذبي واري ڪالمن کي واپس ڪليڪشن ٽيوب ۾ وجھو، باقي حل کي جذب ڪرڻ واري ڪالمن ۾ منتقل ڪريو، ۽ 30 – 60 سيڪنڊن لاءِ 12,000 rpm (13,800 × g) تي سينٽرفيوج ڪريو.
4. ايندڙ ڪارڪردگي جو حوالو ڏئي ٿو قدم 5 - 8 جو 08- 1/ جيل ڪڍڻ وارو پروگرام.
درخواستون
TAE يا TBE agarose gel جي مختلف ڪنسنٽريشن؛پي سي آر پروڊڪٽس، اينزيميٽڪ ردعمل سسٽم يا ٻيون خام ڊي اين اي پروڊڪٽس مختلف طريقن سان حاصل ڪيا ويا آهن.کان برآمد ٿيل ٽڪرا70 bp -20 kb.
نوٽس
صرف تحقيق لاء استعمال ڪريو.تشخيصي طريقيڪار ۾ استعمال لاء نه.
1. Buffer GW کي گھٽائڻ لاءِ 80 ml ethanol شامل ڪريو جيئن استعمال ڪرڻ کان اڳ ٽيگ تي ڏيکاريل آھي، ڪمري جي حرارت تي ذخيرو ڪريو.
2. جيڪڏهن بفر جي ڊي پي کي گھٽ درجه حرارت جي اسٽوريج دوران تيز ڪرڻ آسان آهي، ان کي استعمال ڪرڻ کان اڳ وقت جي هڪ عرصي تائين ڪمري جي حرارت تي رکي سگهجي ٿو.جيڪڏهن ضروري هجي ته، ان کي 37 ℃ پاڻيء جي غسل ۾ اڳ ۾ گرم ڪري سگهجي ٿو جيستائين اهو مڪمل طور تي ڦهليل آهي، ۽ پوء ان کي ملائڻ کان پوء استعمال ڪري سگهجي ٿو.
3. اڳواٽ ۾ پاڻي غسل جي گرمي پد 50 ~ 55 ℃ تي مقرر ڪريو.
4. 08-1/جيل ڪڍڻ واري پروگرام جي قدم 1 ۾، جيل سلائس جي سائيز کي گھٽائڻ سان گھلڻ واري وقت ۾ خاصي گھٽتائي ٿيندي ۽ بحالي جي ڪارڪردگيءَ ۾ اضافو ٿيندو (Linearized DNA آسانيءَ سان ھائيڊولائيز ٿي ويندو آھي جڏھن مسلسل تيز گرمي پد تي بي نقاب ٿئي).ڊي اين اي جيل کي ڊگھي وقت تائين UV ۾ نه لڳايو، ڇو ته الٽراوائلٽ روشني ڊي اين اي کي نقصان پهچائي سگھي ٿي.
5. جيل کي 08- 1/جيل ڪڍڻ واري پروگرام اسٽيپ 2 ۾ مڪمل طور تي ٽوڙيو، ٻي صورت ۾ ڊي اين اي جي بحاليءَ جي ڪارڪردگي سخت متاثر ٿيندي.
6. Elution Buffer يا ddH2O کان 55℃ تائين گرم ڪريو، جيڪو ڊي اين اي ايليوشن ڪارڪردگي کي بهتر ڪرڻ ۾ مددگار آهي.اها سفارش ڪئي وئي آهي ته ڊي اين اي کي 2.5 ايم ايم ٽريس-ايچ سي ايل، پي ايڇ 7.0 - 8.5 جي ايلوئنٽ ۾ ذخيرو ڪريو.
