M-MLV ريورس ٽرانسڪرپٽ
RevScript Reverse transscriptase جينياتي انجنيئرنگ ٽيڪنالاجي ذريعي حاصل ڪئي وئي آهي.ان ۾ اعليٰ سي ڊي اين اي ٺهڻ جي صلاحيت، حرارتي استحڪام ۽ رد عمل جي درجه حرارت جي حد (60 ° سي تائين) آهي.ٺهيل cDNA پيداوار 10 kb تائين آهي.اهو ٽيمپليٽس جي لاڳاپي کي وڌائي ٿو ۽ آر اين اي ٽيمپليٽس جي ريورس ٽرانسپشن لاءِ مناسب آهي پيچيده ثانوي ڍانچي يا گهٽ ڪاپي جين سان.
اجزاء
| جزو | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript Reverse Transscriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ايم ايل |
| 5 × RevScript بفر | 250 μL | 1.25 مليل | 5 ايم ايل |
رکڻ جي حالت
هي پراڊڪٽ 2 سالن تائين -25 ° C ~ -15 ° C تي ذخيرو ٿيڻ گهرجي.
يونٽ جي تعريف
هڪ يونٽ 1 nmol dTTP کي تيزاب ۾ حل نه ٿيندڙ مواد ۾ 10 منٽن ۾ 37 ° C تي Oligo (dT) کي پرائمر طور استعمال ڪري ٿو.
رد عمل سيٽ اپ
1.آر اين اي ٽيمپليٽ جي تباهي (هي قدم اختياري آهي، آر اين اي ٽيمپليٽ جي تباهي ثانوي جوڙجڪ کي کولڻ ۾ مدد ڪري ٿي، جيڪا پهرين اسٽينڊ سي ڊي اين اي جي پيداوار کي بهتر بڻائي ٿي.)
| اجزاء | حجم (μL) |
| RNase مفت ddH2O | 13 تائين |
| اوليگو (ڊي ٽي)18 (50 μmol/L) يا بي ترتيب پرائمر (50 μmol/L) يا جيني مخصوص پرائمر (2 μmol/L) | 1 |
| يا 1 | |
| يا 1 | |
| آر اين اي ٽيمپليٽ | X a |
نوٽس:
1) الف: ڪل RNA: 1-5 ug يا mRNA: 1-500 ng
2) 65 ° C تي 5 منٽن لاءِ انڪيبيٽنگ ڪريو، پوءِ فوري طور تي برف تي منتقل ڪريو 2 منٽن لاءِ ٿڌي ڪرڻ لاءِ.ردعمل مائع گڏ ڪرڻ لاءِ مختصر سينٽرفيوگريشن، ريورس ٽرانسڪرپشن ردعمل حل شامل ڪريو جيئن ھيٺ ڏنل جدول ۾ ڏيکاريل آھي.ملائڻ لاء نرمي سان پائپٽ.
1.ردعمل جي مرکب جي تياري (20 μL حجم)
| اجزاء | حجم (μL) |
| اڳئين قدم جو مرکب | 13 |
| 5 × بفر | 4 |
| dNTP مکس (10nmol/L) | 1 |
| ريورس ٽرانسڪرپٽ (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
1.هيٺين حالتن هيٺ رد عمل انجام:
| گرمي پد (°C) | وقت |
| 25 °Ca | 5 منٽ |
| 42 °Cb | 15-30 منٽ |
| 85 °Cc | 5 منٽ |
نوٽس:
1) هڪ.5 منٽ لاءِ 25 ° C تي incubating صرف بي ترتيب هيڪسامرز استعمال ڪرڻ لاءِ گهربل آهي.مھرباني ڪري ھن قدم کي ڇڏي ڏيو جڏھن Oligo (dT) استعمال ڪريو18يا جين مخصوص پرائمر.
2) ب.تجويز ڪيل ريورس ٽرانسڪرپشن جو گرمي پد 42 ° C آهي، پيچيدگين ثانوي ساخت يا اعلي GC مواد سان ٽيمپليٽس لاء، اها سفارش ڪئي وئي آهي ته رد عمل جي درجه حرارت کي 50-55 ° C تائين وڌايو وڃي.
3) ج.ريورس ٽرانسڪرپٽ کي غير فعال ڪرڻ لاءِ 5 منٽ لاءِ 85 ° C تي گرم ڪريو.
4) پيداوار سڌو سنئون PCR يا qPCR رد عمل ۾ استعمال ڪري سگهجي ٿو، يا مختصر مدت جي اسٽوريج لاء -20 ° C تي ذخيرو ٿيل.اها سفارش ڪئي وئي آهي ته شين کي aliguot ۽ اسٽوريج -80 ° C تي ڊگهي مدت اسٽوريج لاء.بار بار منجمد ٿيڻ کان پاسو ڪريو.
5) پيداوار هڪ قدم RT-qPCR لاءِ موزون آهي، اها سفارش ڪئي وئي آهي ته هر 25μL رد عمل واري نظام لاءِ 10-20 يو ريورس ٽرانسڪرپٽ شامل ڪيو وڃي، يا اصل صورتحال جي مطابق ريورس ٽرانسڪرپٽ جي مقدار کي آهستي آهستي وڌايو وڃي.
نوٽس
1.مھرباني ڪري تجرباتي علائقو صاف رکو؛آپريشن دوران صاف دستانا ۽ ماسڪ پائڻ گهرجن.تجربن ۾ استعمال ٿيندڙ سڀئي استعمال ٿيندڙ شيون RNase جي آلودگي کي روڪڻ لاء RNase آزاد هجڻ گهرجن.
2.آر اين اي جي تباهي کي روڪڻ لاءِ سڀئي طريقا برف تي ڪيا وڃن.
3.ريورس ٽرانسپشن جي اعلي ڪارڪردگي کي يقيني بڻائڻ لاء اعلي معيار آر اين اي نموني جي سفارش ڪئي وئي آهي.
4.هي پيداوار صرف تحقيق جي استعمال لاء آهي.
5.مھرباني ڪري پنھنجي حفاظت لاءِ ليب ڪوٽن ۽ ڊسپوزيبل دستانن سان ڪم ڪريو.
