N-Glycan کٽ

اجزاء

N-گليڪن ڪٽ (24T)

پروٽوڪول

استعمال ڪندڙ کي توھان جي شروعات ڪرڻ کان پھريان ھيٺ ڏنل ريجنٽ ۽ ڊوائيس تيار ڪرڻ جي ضرورت آھي (مثال طور ھڪڙو IgG نمونو):

(1) 0.85٪ Nacl، 100µL؛acetonitrile (LC-MS گريڊ)؛ الٽرا پيور پاڻي؛

(2) 15/85 = الٽرا پيور پاڻي / ايسٽونائيٽريل حل (v/v)، 2mL؛1/9/90=فارمڪ ايسڊ/الٽرا پيور واٽر/ايڪيٽونائيٽريل(v/v)،20mL；50mM امونيم فارميٽ،PH=4.4،500mL；

(3) SPE ويڪيوم پمپ؛96-پليٽ منفي پريشر پروسيسر يا مثبت پريشر پروسيسر؛حرارتي ماڊل يا ڌاتو غسل (90℃ ۽ 50℃)؛vortex ميڪر؛ پائپٽ.

قدم 1: تيز ڊيگليڪوسيليشن

(1) IgG نموني کي 0.85٪ Nacl سان ٺهڪيو ته IgG فائنل ڪنسنٽريشن 2mg/mL تي حاصل ڪريو.

(2) PNGase F بفر: dilute 1 vial surfactant (1.2mg/3.6mg) with (24μL/72μL))PNGase F بفر، ملايو ۽ ڪمري جي حرارت تي ذخيرو ڪريو (هن حل کي استعمال ڪرڻ کان اڳ تيار ڪرڻ جي ضرورت آهي).

(3) 20μL IgG حل شامل ڪريو 200μL رد عمل واري ٽيوب ۾، 3μL PNGase F بفر شامل ڪريو، پائپٽ مٿي ۽ هيٺ ملايو ۽ پوءِ 3.3μL الٽرا پيور پاڻي شامل ڪريو، ملائڻ لاءِ اسپيريٽ ۽ ڊسپنس.

(4) مٿيون سڀ حل شامل ڪريو حرارتي ماڊل ۾ 90 ℃، 3 منٽن تي، ان کي رد ڪريو، ۽ پوء ان کي حرارتي ماڊل مان ڪڍيو، ۽ ڪمري جي حرارت تي 3 منٽن لاء ٿڌو.

(5) شامل ڪريو 1.2μL PNGase F، aspirate ۽ dispense to mix، گرمي 50℃، 5 منٽ حرارتي ماڊل سان.صارف انتظار ڪرڻ دوران ليبلنگ ريگينٽ تيار ڪري سگھن ٿا.

(6) ان کي گرم ڪرڻ واري ماڊل مان ڪڍو، ۽ پوءِ 3 منٽن لاءِ ڪمري جي حرارت تي ٿڌي.

قدم 2. Glycosylamines جي تيز ليبلنگ

(1) ليبلنگ ريجينٽ حل: هڪ شيشي ليبلنگ ريجينٽ (8.2mg/24.6m）) کي اينهائيڊروس DMF (60. 13μL/180.4μL) سان ملايو، هن حل کي استعمال ڪرڻ کان اڳ تيار ڪرڻ جي ضرورت آهي)، پڪ ڪرڻ لاءِ 5-10 ڀيرا اسپيريٽ ڪريو ۽ ڊسپينس ڪريو. reagent مڪمل طور تي ڦهليل آهي.

(2) 6μL ليبلنگ ريجنٽ حل شامل ڪريو رد عمل واري ٽيوب ۾، 5-10 ڀيرا اسپيريٽ ڪريو ۽ ورهايو، ملائڻ کي يقيني بڻائڻ لاء، ۽ پوء ليبلنگ رد عمل کي ڪمري ۾ اڳتي وڌڻ جي اجازت ڏيو.

5 منٽن لاء گرمي پد.

(3) 179 μL acetonitrile شامل ڪريو، ايندڙ قدم لاء ملايو.

قدم 3: صاف ڪرڻ ليبل ٿيل Glycosylaبارودي سرنگون

(1) منفي پريشر پروسيسر يا مثبت پريشر پروسيسر ۽ 96-اوائلي ايليوشن پليٽ قائم ڪريو.

(2) کنڊيشن کوهه: 200μL الٽرا پيور پاڻي ايليوشن پليٽ ۾ شامل ڪيو وڃي ته جيئن کوهن کي حالت ۾ رکي، ويسٽ ٽري ذريعي فضول گڏ ڪيو وڃي.

(3) کوهه برابر ڪريو: 200μL 15/85 واٽر/ايڪيٽونائٽرائل سلوشن (v/v) شامل ڪريو کوهن کي برابر ڪرڻ لاءِ، فضول کي گڏ ڪريو ويسٽ ٽري ذريعي.

(4) نمونو لوڊ ڪريو: acetonitrile ملائي ٿيل نموني کي لوڊ ڪريو ۽ فضول ٽري ذريعي فضول گڏ ڪريو.

(5) کوهن کي 600μL 1/9/90 فارمڪ ايسڊ/الٽرا پيور واٽر/ايڪيٽونائيٽريل (v/v) سان ٻه ڀيرا ڌوئو ۽ ويسٽ ٽري ذريعي ڪچرو گڏ ڪريو.

(6) فضول ٽري کي هٽايو، ۽ ان کي گڏ ڪرڻ واري پليٽ ۾ تبديل ڪريو.

(7) سيل کي 50μL ايليوشن بفر سان ڌوئي، ڪليڪشن پليٽ ۾ گلائڪن کي ايلوٽ ڪريو، ۽ هن قدم کي ورجايو.

(8) شامل ڪريو 200μL نموني diluent، ان کي ملايو.

قدم 4. HILIC-FLR

(1) ڪروميٽوگرافي ڪالمن: ACQUITY UPLC® Glycan BEH Amide, 130 Å, 1.7 μm, 2. 1 x 150 mm (water part #186004742).

(2) ڪالمن جو گرمي پد: 60 ° C

(3) مائع مرحلو A: 50 mM امونيم فارميٽ حل (LC-MS گريڊ سفارش ڪئي وئي آهي)، pH = 4.4.

(4) مائع مرحلو B: 100٪ acetonitrile (LC-MS گريڊ آھيسفارش ٿيل).

(5) وهڪري جي شرح: 0.4 ايم ايل / منٽ؛

(6) درجه بندي:

(7) FLR موج جي ڊيگهه: EX 265 / EM 425 nm

(8) FLR نموني جي شرح: 2 Hz

(9) انجيڪشن والیوم: 10μL

مهرباني ڪري نوٽ ڪريو ته مٿين پيرا ميٽرن جي بنياد تي مشين سان ليس آهي “ACQUITY® RDa”LCMS، صارف ٻين سامان جي مطابق پيٽرول کي ترتيب ڏئي سگهي ٿو.

Sٽوڙ

نوٽس

توهان جي حفاظت ۽ صحت لاءِ، مهرباني ڪري ليبارٽري ڪوٽ ۽ دستانو پائڻ.

هر ڀيري صاف صلاحون استعمال ڪريو

مھرباني ڪري ھدايت جي پيروي ڪريو ريگينٽس کي ذخيرو ڪرڻ ۽ استعمال ڪرڻ لاء